阿卡宁衍生物合成产物中-中山大学化学与化学工程学院.docVIP

阿卡宁衍生物合成产物中 乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选 左娜娜 马志玲* (中山大学化学学院分析化学研究所，广州，510275) 摘要 本文以合成得到的乙酰胆碱酯酶抑制剂混合物为研究对象，通过紫外分光光度法检测出混合物是否具有活性，进一步通过高效薄层色谱法（HPTLC）确定活性物质的个数以及位置，接着通过液相－质谱（LC-MS）联用等方法对活性物质定性分析。混合物体系，通过本实验的方法，不经分离提纯即可测定各种化合物是否具有抑制能力以及抑制活力的大小，包括各种副产物，因而可以获得合成体系中有关抑制剂的最大的信息量。 关键词 乙酰胆碱酯酶 抑制剂 筛选 1 前言 阿尔茨海默病（Alzheimer’s，AD）是一种多发生于老年人中的缓慢进行性、智能衰退性疾病，俗称老年性痴呆病。AD的关键性症状主要是由胆碱能功能障碍所引起的，治疗AD病的主要途径是寻找新的中枢拟胆碱药，乙酰胆碱酯酶抑制剂就是其中的一类治疗药物。 传统的药物筛选方法是定向合成再定向筛选，即首先通过化学预试寻找到药物先导物，接下来设计合成路线，对产物进行分离纯化，最后检验活性。传统筛选方法有两个主要缺陷，一是传统活检只能应用于纯品，该方法只适用于易分离体系，对难分离混合物体系暂时没有解决办法；二是传统定向合成只关注主合成产物，无视副产物也可能会有活性等信息。 而在本方法中，合成产物不需经过分离和纯化，可以直接筛选出活性物质并对其定性。本文以合成得到的乙酰胆碱酯酶抑制剂混合物为研究对象，通过紫外分光光度法检测出混合物是否具有活性，进一步通过高效薄层色谱法（HPTLC）确定活性物质的个数以及位置，接着通过高效液相色谱法（HPLC）以及液相－质谱（LC-MS）联用等方法对活性物质定性分析。 这种筛选方法，克服了传统筛选方法的弊端，讲求整体性，对任意的合成体系，可以判断出产物是否具有活性、活性物质的位置以及活性物质的结构，这对药物筛选有重要的指导意义。 (基金项目：中山大学化学与化工学院第五届创新化学实验与研究基金项目资助 第一作者 左娜娜，女，中山大学化学与化工学院应用化学专业2001级 指导老师 马志玲，中山大学化学院，副教授， Email：cesmzl@zsu.edu.cn 2实验部分 2.1抑制剂混合物体系的合成 反应步骤如下：在两个50ml圆底烧瓶中，分别加入50mg原料和5ml甲醇，搅拌溶解；分别加入2-氨基吡啶和2-氨基代苯骈噻唑50mg；室温状态下搅拌72h；用薄层色谱法监测反应的进行程度，必要时加入催化剂硼酸（催化量）；反应结束后，用氮气把溶剂吹干，再用三氯甲烷溶解；转入分液漏斗中，用水洗两次，每次5ml。合并提取液，用无水硫酸钠干燥；把干燥后的反应液用氮气把溶剂吹干，用2.5ml甲醇溶解。密封，冷冻保存，备用。 2.2乙酰胆碱酯酶抑制剂的活力测定（IC50的测定） 分别吸取一定量的抑制剂溶液（1mg/ml），20μlL4mg/ml的DTNB溶液，5μL0.1mg/ml乙酰胆碱酯酶溶液和 pH＝8.0磷酸盐缓冲溶液，置于酶反应管中，于37℃下恒温30分钟，加入20μL2mg/ml氯化乙酰胆碱，迅速混和均匀后，倒入500μL的比色皿，测试λ=432nm处的吸光度，记录吸光度随反应时间的变化。以抑制剂溶液的浓度为横坐标，乙酰胆碱酯酶活力（OD432）为纵坐标作图。 2.3薄层色谱法筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂 2.3.1分离乙酰胆碱酯酶抑制剂混合物 将抑制剂混合物配成1mg/ml的甲醇溶液，吸取2 μL在2.5×10 cm的薄层板上进行点板，然后在下列展开剂体系中展开。 三氯甲烷：石油醚：乙酸乙酯＝1.0：2.9：1.1； 0.4 ml的0.1 mol/L的HCl甲醇溶液；流动相走过的距离为8.0 cm。 2.3.2鉴别具有抑制能力的化合物 乙酰胆碱在乙酰胆碱酯酶存在的条件下发生的水解反应如下： Acetylthiocholine + H2O → acetate + thiocholine Thiocholine+DTNB→2-nitrobenzoate-5-mercaptothiocholine+5-thio-2-nitrobenzoate(yellow） μL在2.5×10 cm硅胶板上进行点板，然后在2.3.1中的展开剂体系中展开，逐次喷上2 mg/ml的氯化乙酰胆碱和4 mg/ml的DTNB溶液，使得整块硅胶板被饱和而其上的样品斑点不至于脱落。自然放置5 min，使硅胶板晾干。最后喷上0.1 mg/ml的酶溶液。大概5 min后可以看到硅胶板黄色背景上出现白色圆圈，该现象应在15 min内观察记录，20-30 min内会自然消失。 2.4 液相－质谱联用法测定各种抑制剂化合物的分子量及分子结构 将抑制剂样品配成1 mmol