PCR技术及其的应用.ppt

第六章 PCR技术及其应用 §1 PCR技术原理 §2 PCR技术应用 二、PCR的基本原理 类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。 PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC) PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences PCR Cycle - Step 3 - At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated End of the 1st PCR Cycle – Results in two copies of target sequence Target Amplification PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 五、PCR引物的设计一般原则 ①引物长度一般以18～30bp为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。 ②避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。 ③G/C和A/T碱基均匀分布， G+C含量在40～60%之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。 ④要避免两个引物间特别是3`末端碱基序列互补以及同一引物自身3`末端碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。 ⑤引物3`末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3`末端为G、C或T时引发效率较高。 ⑥引物5`末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。 ⑦引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。 六、PCR中应注意的事项 （一）防止污染 试剂小量分装 吸头及EP管一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操作 （二）设立对照： 阳性对照： 阳性模板 阴性对照： 阴性模板 试剂对照： 除模板外的所有组分 一、PCR技术的主要类型 ㈠反向PCR 　 ㈥锚定PCR ㈡不对称PCR ㈦原位PCR ㈢RT-PCR 　　　　　　㈧重组PCR ㈣差异显示PCR　　　　㈨免疫PCR ㈤实时定量PCR　　　　㈩多重PCR 3）RT－PCR:是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR反应,用于测定基因表达的强度和鉴定已转录序列是否发生突变,呈现mRNA多态性,克隆mRNA的5’和3’末端序列,以及从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库。 5）实时定量PCR技术原理 实时定量PCR（也称TaqMan PCR,以下简称FQ-PCR）是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与变通PCR相比，FQ-PCR具有许多优点。 实时定量PCR(real-time PCR): 通过特定设计的PCR仪器来实时检测PCR扩增过程每一轮循环产物的累积数量，可以很好的推算模板的起始浓度，这种工作方式称为实时定量PCR。 实时荧光定量PCR: 实时定量PCR在检测过程中通过检测标记的荧光信号的累积来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，故称为实时荧光定量PCR。 原理和方法FQ-PCR的工作原理是利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5’端标以荧光发射基因FAM（荧光发射峰值在518nm处），靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA（荧光发射峰值在582nm处），探针的3’端被磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发