代谢课答案.docVIP

2. 代谢改造思路和代谢设计原理 代谢改造思路 ?代谢工程研究的重点在于改造代谢网络，以便生产特定目的代谢产物或具有过量生产能力的工程菌应用于工业生产。根据微生物的不同代谢特性，常采用改变代谢流、扩展代谢途径和构建新的代谢途径三种方法。 (1)改变代谢途径方法 ?1)加速限速反应 增加限速酶的表达量，来提高产物产率。然而限速酶反应的改变可能会给整个代谢网络带来负面影响。 2)改变分支代谢途径流向 提高代谢分支点某一分支代谢途径酶活力，使其在与其它的分支代谢途径的竞争中占据优势，从而提高目的代谢产物的产量。 (2)扩展代谢途径 在宿主菌中克隆和表达特定外源基因，从而延伸代谢途径，以生产新的代谢产物和提高产率。扩展代谢途径还可使宿主菌能够利用自身的酶或酶系消耗原来不消耗的底物。 (3)转移或构建新的代谢途径 通过转移代谢途径、构建新的代谢途径等方法来实现。 代谢设计原理 一、现存代谢途径中改变增加目的产物代谢流 (1) 增加限速酶编码基因的拷贝数 没有改变代谢流，只是增加了酶的量，提高了中间物的浓度，从而提高限速反应的反应速率。 (2) 强化以启动子为主的关键基因的表达系统可以提高产物的转化率 (3) 提高目标途径激活因子的合成速率 (4)灭活目标途径抑制因子的编码基因 (5) 阻断与目标途径相竟争的代谢途径 (6) 改变分支代谢途径流向 提高某一分支途径中的酶活力，从而使该分支途径在竟争中处于有利的地位。 (7) 构建代谢旁路 大肠杆菌糖代谢未端产物乙酸能抑制菌体的生长，应用代谢工程的方法将枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶基因克隆到大肠杆菌中，构建新的代谢旁路，结果能明显的降低细胞中的乙酸浓度，使乙酸始终处于较低的水平。 (8) 改变能量代谢途径 如：将血红蛋白基因导入大肠杆菌或链霉菌中，不仅在限氧条件下可以提高宿主细胞的生长速率，而且也可以促进蛋白和抗生素的合成。血红蛋白的作用在于在限氧条件下提高了ATP的产生效率。 二、在现存途径中改变物流的性质 指使手原有途径更换初始底物或中间产物，以达到获得新产物的目的。可以通过以下两种方法： (1) 利用酶对前体库分子结构的宽容性 如利用酶的相对专一性，投入非理想型初始底物参与代谢转化反应，就可以进而合成细胞原不存在的化合物。 (2) 通过修饰酶分子以拓展底物识别范围 修饰酶分子的结构域功能域，以扩大酶分子对底物的识别范围和催化范围。 三、在现存途径基础了扩展代谢途径 在宿主菌中克隆、表达特定外源基因可以延伸代谢途径，从而生产新的代谢产物、提高产率。 3. 微生物的基因操作技术有哪些？（举两例说明） ：核酸的凝胶电泳：将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷（电荷密度），因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）染色，由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。 ：核酸的分子杂交技术 其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下(适宜的温室度及离子强度等)可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针(probe),待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等 核酸分子杂交技术主要有以下几种: Southern 杂交 、Northern 杂交 、原位杂交(ISH) 荧光原位杂交(FISH) 、芯片杂交(属于固一液相杂交) 在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳 分离的DNA或RNA分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印” 转移到滤膜上的。常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM）和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE） ：细菌的转化：是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫做