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《基因工程实验》讲义 指导教师 林陈水 浙江工业大学药学院 2015年11月 目 录 实验一、质粒DNA的碱裂解法提取与纯化 实验二、DNA分子的限制性内切酶消化 实验三、聚合酶链式反应(PCR)扩增目的DNA 实验四、大肠杆菌感受态细胞制备及质粒DNA转化 实验五、重组外源基因在大肠杆菌中的诱导表达 实验六、表达蛋白的SDS分析 实验一、质粒DNA的碱裂解法提取与纯化 一、实验目的与内容 1、细菌培养及菌体的收集、裂解。 2、碱裂解法提取质粒DNA。 二、实验原理 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，其重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 目前大部分实验室采用柱层析法纯化质粒DNA。操作步骤及注意事项详见试剂盒产品说明书。 三、试剂准备 1．溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl(pH 8.0)12.5 mL，0.5M EDTA(pH 8.0)10 mL，葡萄糖4.730 g，加ddH2O至500 mL。在10 lbf/in2高压灭菌15 min ，贮存于4℃。 2．溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1 mL，10%SDS 1 mL，加ddH2O至10 mL。使用前临时配置。 3．溶液Ⅲ：醋酸钾(KAc)缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300 mL，冰醋酸 57.5 mL，加ddH2O至500 mL。4℃保存备用。 4．TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl(pH 8.0)1 mL，0.5M EDTA(pH 8.0)0.2 mL，加ddH2O至100 mL。高压湿热灭菌30 min，4℃保存备用。 5．苯酚(Tris-HCl(pH 8.0)平衡)、氯仿/异戊醇(24：1) 6．乙醇(无水乙醇、70%乙醇) 7．10×TAE缓冲液(pH8.0)：Tris 48.48 g，冰乙酸11.42 mL，EDTA3.72 g，定容至1000 mL。 8．溴化乙锭(EB)：10m g/ mL。本实验采用新型无致癌性的DNA染料代替。 9．RNase A(RNA酶A)：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10m g/ mL，TE配制，沸水加热15 min，分装后贮存于-20℃。 10．6×loading buffer(上样缓冲液)：0.25%溴酚蓝，40%(m/V)蔗糖水溶液。 11．0.8%琼脂糖凝胶：称取1.2 g琼脂糖于三角烧瓶中，加150 mL 0.5×TAE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右(不烫手)，加EB母液(10 mg/mL)至终浓度0.5 ug/mL(注意：EB为强诱变剂，操作时带手套)，轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30 min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中(电泳缓冲液0.5×TAE)，即可上样。 四、操作步骤 1．挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于3 mL LB(含相应抗生素)液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜(约12-14hr)。 2．取1.2 mL培养物入离心管中，室温离心10000 g×0.5 min，弃上清，将离心管倒置，用真空泵将上清液小心吸尽。 3．将细菌沉淀重悬于100 μL