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标题：细菌革兰氏染色作业指导书 版本号：A 修订号：0 文件编号：SMXGKYY -SOP-001 发布日期：2015年04月01日 生效日期：2015年04月01日 发布部门：质量管理小组 编制人： 审核人： 批准人（签字）： 革兰氏染色 目的 更好的观察细菌形态，并可按染色反应加以分类鉴别。 原理 化学学说：碘液在菌体内与结晶紫结合后又和菌体内的核糖核酸镁盐—蛋白质复合物结合，此结合物不易被95%乙醇脱掉，呈革兰氏染色阳性。因革兰氏阴性菌缺乏核糖核酸镁盐，故对碘与结晶紫结合物摄取少，且不牢固，易被乙醇脱色，而呈革兰氏染色阴性。 等电点学说：革兰氏阳性菌的等电点在PH2—3，比阴性菌（PH4—5）更低。加之碘为弱氧化剂，可降低革兰氏阳性菌的等电点，使两类菌的等电点差异扩大。因此，阳性菌和碱性染料的结合力比阴性菌更强。 渗透性学说：阳性菌含粘肽多、糖多，酒精使其脱水而致细胞壁间隙缩小，通透性降低，在菌体内保留了染料—碘复合物，故呈紫色。阴性菌胞壁含粘肽少，通透性不受影响，菌体内染料—碘复合物较易透出，失去紫色，被复染成为红色。 标本 痰涂片、分泌物涂片、细菌涂片等。 染液 第一液：结晶紫乙醇饱和液（2g结晶紫溶于95%乙醇20ml内）+10g/l草酸铵水溶液80ml混匀。 第二液：碘1g，碘化钾2g，加少许蒸馏水，充分振摇，溶解后加蒸馏水至300ml。 第三液：95%乙醇或乙醇、丙酮（7：3）混合液。 第四液：稀释碳酸复红或沙黄溶液（2.5%沙黄乙醇液10ml加蒸馏水90ml混匀）（碱性复红8g溶于95%酒精100ml中制成饱和液，取10ml加入5%碳酸水溶液90ml混匀）用时用蒸馏水稀释10倍即可。 质量控制措施 每周做一次革兰氏阴、阳性质控菌株染色对照（金葡菌、大肠杆菌）。 操作步骤 已固定的细菌（或其它）涂片，滴加第一液染1分钟水洗。 冲去残水滴加第二液，媒染1分钟，水洗。 去残水，用95%酒精脱色，至无明显紫色液渗出为止，水洗。 用第四液复染10—30秒钟，水洗，干后镜检。 结果可报区间 革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 实验室解释 染色关键在于涂片和脱色，故涂片要厚薄适宜。脱色时若涂片上有水分，则脱色力强，易形成假阴性。 涂片干燥宜自然干燥，固定时通过火焰三次即可，不宜过分，以免造成菌体变性而影响染色效果。 染色反应受菌龄影响，故所染色的细菌培养不超过24—48h。 安全防护措施 操作中，穿好工作衣，戴防护口罩、手套，必要时戴眼罩，严格按操作规程，结束后，用0.2%消毒灵擦拭实验台、显微镜手柄、载物台等，然后用0.2%消毒灵泡手，实验室用紫外线消毒30分钟。 标本处理 已检验过的标本作高压灭菌后由专门人员统一处理。 十一、参考文献 诊断细菌学，李仲兴等主编，第一版，香港：黄河文化出版社 标题：细菌培养技术 版本号：A 修订号：0 文件编号：SMXGKYY -SOP-001 发布日期：2015年04月01日 生效日期：2015年04月01日 发布部门：质量管理小组 编制人： 审核人： 批准人（签字）： 细菌培养技术 目的：无菌操作接种、培养是细菌学实验室中最基本、最重要的操作技术，它是鉴定细菌的首要前提。 器材：酒精灯、95%酒精、接种环（针）、培养皿（瓶）、烛缸、火柴等。 无菌操作技术的基本要求 临床细菌检验的所有操作，均必须在无菌条件下进行，即在酒精灯火焰附近或在超净工作台内进行。 由临床标本或培养物中取材作检查时，必须使用接种环（针），使用前后均需火焰灭菌。 从培养瓶或试管培养物中取标本时，在打开瓶口、试管口或关闭前，均要在火焰上通过1—2次，瓶塞或试管塞用无名指及小指夹住，操作完毕后塞回。 不慎打破培养物瓶（管）时，应报告负责人后，用0.2%消毒灵处理污染的台面或至少覆盖30分钟。打破的器皿集于容器内高压灭菌，台面及地面再进一步消毒清洗。 工作完毕后，实验台用0.2%消毒灵擦拭，双手用0.2%消毒灵浸泡，再用肥皂和清水刷洗干净。. 接种方法 平板接种法：平板划线接种是细菌分离培养的常用技术，主要使标本或培养物中的混合细菌能在培养基表面分散生长形成单个菌落。 曲线划线分离法：接种环菌灭后挑取标本或菌液少许呈45度角，在平板1/5处轻轻涂布，然后左右来回以曲线形成划线接种，倒置37℃温箱内培养24h后观察结果。 分区划线分离法：接种环于平板内分划五区，每划完一个区域烧灼环一次后倒置35—37℃培养。 穿刺接种法：多用于保存菌种观察动力及做厌氧培养，亦可用于观察细菌对糖类的分解反应，培养基为半固体。 方法：1、左手持细菌培养物。 2、右手持接种针酒精灯上烧灼，冷却后挑取细菌。 3、左手持半固定培养基，右手