蛋白浓度测定(完成).docx

蛋白浓度测定蛋白质的定量分析是生物化学和其它生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。 蛋白质是一种十分重要的生物大分子：它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法代来了许多具体的困难。目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：物理性质：紫外分光光度法化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry 法，BCA法，胶体金法染色性质：考马氏亮蓝染色法、银染法其他性质：荧光法 蛋白质测定的方法很多，但每种方法都有其特点和局限性，因而需要在了解各种方法的基础上根据不同情况选用恰当的方法，以满足不同的要求。例如凯氏定氮法结果最精确，但操作复杂，用于大批量样品的测试则不太合格；双缩脲法操作简单，线性关系好，但灵敏度差，样品需要量大，测量范围窄，因此在科研上的应用受到限制；而酚试剂法弥补了它的缺点，因而在科研中被广泛采用，但是它的干扰因素多；考马氏亮兰染色法因其灵敏而又简便开始重新受到关注；BCA法又以其试剂稳定，抗干扰能力较强，结果稳定，灵敏度高而受到欢迎；胶体金法具有较高的灵敏度，可达到毫微克水平，用于微量蛋白的测定。常用的测定蛋白质含量方法的比较方 法测定范围（μg/ml）不同种类蛋白的差异最大吸收波长(nm)特 点凯氏定氮法?小?标准方法，准确，操作麻烦，费时，灵敏度低，适用于标准的测定紫外分光光度法100—1000大280205灵敏，快速，不消耗样品，核酸类物质有影响双缩脲法1000—10000小540重复性、线性关系好，灵敏度低，测定范围窄，样品需要量大Folin-酚试剂法20—500大750灵敏，费时较长，干扰物质多考马氏亮蓝G-25050—500大595灵敏度高，稳定，误差较大，颜色会转移BCA50—500大562灵敏度高，稳定，干扰因素少，费时较长由于凯氏定氮法的操作作过于复杂，双缩脲法的灵敏度又太低，下面介绍Folin—酚试剂法，考马氏亮蓝G—250染色法，紫外分光光度法、胶体金法等几种最常用使用的方法。试验一：BCA法BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织细胞裂解实验中，常用浓度的去垢剂SDS，Triton X-100，Tween不影响检测结果，但受螯合剂(EDTA，EGTA)、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类的影响。基本原理：碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。主要特点 1. 准确灵敏, 线性范围广： BCA试剂的蛋白质测定范围是10－2000ug/ml； 2. 快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便。 3. 经济实用：在微孔板中进行测定，可大大节约样品和试剂用量。 4. 不受样品中离子型和非离子型去污剂影响。 5. 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马氏亮蓝。试剂要求 BCA试剂A, B液室温保存，蛋白标准(5mg/ml) -20℃保存仪器准备96孔板，酶标仪，37℃恒温箱使用说明 1. 配制工作液: 根据标准品和样品数量，按体积比A ：B （50：1）配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。2. 稀释标准品：取10微升标准品用PBS稀释至100ul（标准品一般可用PBS稀释），使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20ul加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足到20ul。或者依照下面的表格中设置的浓度做标准曲线。 3. 加适当体积样品到96孔板的样品孔中，补加PBS到20ul。一般蛋白样品可以几个不同的稀释比例检测，常用的是每孔中加入1ul，2ul，4ul样品，补加PBS到20ul。 4. 各孔加入200ul BCA工作液，37℃放置30分钟。5. 冷却到室温，用酶标仪562nm测定OD值，根据标准曲线计算出蛋白浓度。20ul体系蛋白浓度mg/ml加入C液量ul补足PBS量ul00200.00.418.40.52180.62.416.414161.561428122.5101031283.514641645200注意事项1. 在低温条件或长期保存出现沉淀时，可搅拌或37℃温育使溶解, 如发现细菌污染则应丢弃。2. 样品中若含有EDTA、EGTA、DTT、硫酸铵、脂类会影响检测结果，请试用Bradford蛋白浓度测定试剂盒；高浓度的去垢剂也影响实验结果，可用TCA沉淀去除干扰物质。 3．要得到更为精确的蛋白浓度结果，