哺乳动物细胞冷冻保存.docVIP

?哺乳动物细胞冷冻保存 主要目的： （1）保存种子细胞，以便随时取用。这是保存细胞的最主要目的。 （2）减少细胞被微生物污染的危险性。 （3）减少细胞之间交叉污染的危险性。 （4）减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变。 （5）避免有限细胞系出现衰老或恶性转化。 （6）降低人力和物力。 冷冻保存要点： （1）冷冻过程要缓慢。需要冷冻保存的细胞先在4冰箱中放置 30－60 分钟；然后转入-20，放置30 分钟；然后再转入-80放置16－18 小时（或过夜）；最后放入液氮中长期保存。有条件的地方，可用程控降温仪，按每分钟-1 到 -3速度降温，一直到-80以下，然后直接放入液氮中长期保存。 （2）冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％，无微生物污染。 （3）细胞浓度控制在：1×107－5×107/ml。 （4）使用高浓度血清或蛋白保护剂。一般情况下，用于冷冻保存完全细胞生长培养液中血清浓度大于20％。 （5）使用合适的细胞冷冻保护剂，以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏。目前，最常用的冷冻保护剂是DMSO 二甲基亚砜 ，使用终浓度为5－10％。但是，有些细胞系不能用DMSO作为冷冻保护剂，如人白血病细胞系HL-60。因为，DMSO 能诱导HL-60 细胞分化。在这种情况下，可选用其它冷冻保护剂，如甘油（glycele）,羟乙基淀粉等。 特别注意： （1）细胞在冷冻过程中在-20冰箱内放置时间不可超过1 小时，以防止冰晶过大而破坏细胞。也可跳过-20这一步骤直接放入-80冰箱中，但这样做细胞存活率要低一些。 （2）DMSO 稀释时会释放大量热量。因此，DMSO 不能直接加到细胞液中，必须事先配制。 （3）DMSO 必须是细胞培养级别的。新买的DMSO 本身处于无菌状态，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管或瓶中，4保存。避免反复冻融造成DMSO 裂解产生有害物质。并可减少污染机会。如要过滤DMSO，必须选用耐DMSO 的尼龙滤膜。细胞冷冻保存液主要成分：冷冻保护剂，基础培养液，血清或蛋白。 常用细胞冷冻保存液： （1）10％DMSO ＋ 完全细胞生长培养液（20％血清＋基础培养液） （2）10％甘油＋ 完全细胞生长培养液（20％血清＋基础培养液）悬浮细胞冷冻保存操作程序（液氮保存法）： （1）取对数生长期细胞培养物，离心200－400g 5 分钟。用粘附（贴壁）细胞冷冻保存操作程序（液氮保存法）： （1）冷冻保存细胞的解冻与复苏要点：（1）快速解冻。冻存细胞从液氮中取出后，应立即放入37水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）。 （2）解冻操作过程动作要轻。由于冷冻保存过的细胞变得非常脆弱，不仅解冻速度要快，而且动作要轻。一般情况下，解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养（1ml 冻存细胞液加入到25－30ml 新鲜完全培养液中），24 小时后再用新鲜完全培养替换旧培养液，以去除DMSO。如果，细胞对冷冻保护剂特别敏感，那么，解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中。 特别注意： （1）解冻时务必注意安全，预防冷冻管爆裂。，要带手套，用镊子将细胞冷冻管从液氮中取出，放入37水浴中。切不可直接用手，以免冻伤。 （2）冷冻管在水浴中解冻时，液面不可超过冻存管盖面，否则，易发生污染。 解冻冷冻保存细胞的离心方法: （1）从液氮中取出冻存的细胞，立即放入37水浴中快速解冻。 （2）将1－2ml 冻存细胞液加入到25ml 新鲜完全细胞生长培养液中，轻轻混匀。 （3）用80g 离心2－3 分钟，弃上清液。 （4）用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞。 （5）接种细胞到培养瓶中，起始密度为3×105/ml。