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细胞培养污染对策及预防方法 1、细菌污染 §细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素，也可能因为操作不慎而引起污染。 最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。 培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。  小鼠胃癌细胞的球菌感染 白色念珠菌污染：（ 2、真菌污染 真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。 3、支原体污染的检测 （1）相差显微镜观察? §直接取少许培养液滴在载物片上，再盖上盖片观察，支原体在镜下呈暗色微小颗粒，多位于细胞与细胞之间，有时可见类似于布朗运动的表现。 （2）荧光染色法观察? 用荧光染料Hoechst33258，此染料能与DNA特异地结合，可使支原体内的DNA着色，荧光显微镜下支原体呈绿色小点，散在于细胞周围或附于细胞表面。 §（3）电镜检测?  若条件许可，可用扫描电镜或透射电镜观察。一般在细胞培养48～72小时，细胞接近汇合前，用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行固定、包埋、切片后才能进行观察。 §（4）培养检测? §将细胞悬液5mL加入45mL支原体肉汤培养基，培养14天后观察肉汤培养有无雾状沉淀，然后取0.5ml加入已冷却的培养基中，再用琼脂培养基做分离培养，37℃培养3天观察有无“荷包蛋”菌落出现。  PCR法测细胞培养的支原体污染 引物来自支原体的保守16S-23S的rRNA序列，由于这段spacer的序列随支原体种类不同而不同，因此可依所复制的DNA大小及其特异性片段的大小来作检测及鉴定。 一、细菌和真菌的清除  §1、使用抗生素 §抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好。 §预防用药一般用双抗生素，污染后清除用药需采用大于常用量5～10倍的冲洗法，于加药后作用24～48小时，再换常规培养液。此法在污染早期有效。 （二）、支原体的清除  §１、用MRA处理 用支原体?清除剂（Mycoplasma?Removal?Agent）处理细胞，每4天换一次液,连续处理15天以确保细胞纯洁健康．  2、用清洗纯化法清除支原体污染的方法 细胞营养驯化→优质细胞群的筛选→细胞清洗→反复离心洗涤 其原理是利用离心力、细胞、微生物质量和悬液的浮力差达到清除支原体的目的。由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生,所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限. 如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。 ? 3、药物辅助加温处理 先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41℃培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。 ４、使用支原体特异性血清 §用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。  （四）、污染的预防  §预防是防止细胞培养过程中发生污染的最好办法。只有预防工作做在前，才能将发生污染的可能性降到最小程度。 §一般预防： 1、添加抗生素 2、从物品、用品消毒灭菌着手 §细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在无菌试验阴性后才能使用。 §操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。  3、从操作者做起  （1）进无菌室前要用肥皂洗手，按规定穿隔离衣。工作开始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。 （2）操作者动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口转动烧灼。 （3）操作时要常更换吸管 4、防止细胞交叉污染  §在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分。 §在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口，以免把细菌带到培养液中污染其他细胞。 §细胞一旦购置或从别处引入，均应及早留种冻存，一旦发生污染可重新复苏培养。 ５、无菌室的彻底消毒  §1)?0.1%新洁尔灭全面彻底擦洗无菌室； ? §2）甲醛熏蒸法：甲醛是一种广谱灭菌剂菌，其水溶液和气休对各种细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用。 * * 病毒的污染和检测 细胞的直接观察 动物接种检查 电子显微镜观察 免疫学检查 PCR技术 肺 炎 支 原 体 扫 描 电 镜 照 片 鸡 败 血 支 原 体 油 煎 蛋 样 菌 落