分子遗传学5分析.ppt

5.4.5 双链断裂修复系统 细胞内DNA同源重组及修复通常会引起双链断裂（double-strand breaks, DSBs），由外界因素诱发的DNA损伤也可以引起DSBs，如电离辐射、体外培养的细胞等。修复这些DSBs的主要机制为非同源末端连接（non-homologous end-joining, NHEJ）。NHEJ修复系统的机制尚不很清楚，但几个重要的组分，包括Ku蛋白、依赖DNA的蛋白质激酶（DNA-dependent protein kinase, DNA-PKcs）和Artemis蛋白起着非常重要的作用。Ku蛋白包括Ku70（70kD）和Ku80（86kD），两者形成异源二聚合体非特异性结合断裂末端，使两个末端聚集在一起；同时起到脚手架的作用，可以让其它酶依附发挥作用。Artemis蛋白被DNA-PKcs激活后既具有核酸内切酶活性又具有核酸外切酶活性，两个断裂片段突出的末端被修剪，在DNA聚合酶的作用下残缺的碱基被修补，然后由DNA连接酶IV与XRCC4结合将两个端裂片段修复。这种修复保真性不强，容易产生与原来序列不同的碱基（图5-20）。 图5-18 错配修复系统 (引自Benjamin 2006) (a) 错配修复系统示意图 (b) 错配修复系统核心酶体 5.4.4 重组修复 重组修复系统（recombination repair systems）是非常重要的修复机制，它不需要等待修复完成再复制，而是先复制再修复，故又称为复制后修复（post-replication repair）。在DNA复制过程中,DNA聚合酶滑动到损伤位置（如胸腺嘧啶二聚体）时经过短暂的停止后越过损伤部位；生物体利用RecA蛋白质催化DNA分子间的同源联会和交换单链的功能，通过姐妹链交换的机制产生一条完整的DNA链作为下一轮复制的模板。虽然原来的二聚体可能被其它修复系统修复或继续存在，但随着复制的继续，经过若干代后这种含有损伤的DNA在细胞群体中的比例越来越小，对正常的生理功能也很小。由于复制后修复过程涉及同源重组过程，故又称同源重组修复（homologeous recombination repair）（图5-19）。 图5-19 重组修复（复制后修复）（引自 William Michael ,2002） 本图所示重组修复通常发生在DNA复制时跳过一段损害，比如胸腺嘧啶二聚体。通过重组过程，正确的互补序列由未受损害的母本链产生，并且插入到损害序列相对的空隙。新产生的空隙将由DNA聚合酶和DNA连接酶填补。 DNA双链断裂往往难以修复，从而引起大片段基因缺失、或染色体不稳定，表现为染色体畸变，如细胞内的微小染色体、染色体桥等，发生染色体畸变使得患重要疾病的发病率上升，根本原因是控制DNA修复途径或编码修复复合体酶的基因发生了突变。 图5-20 非同源末端断裂修复过程 （引自Benjamin 2006） 5.4.6 SOS修复 当DNA受到大范围损伤或复制受到抑制时而诱导出的一系列反应，称为SOS应答（SOS response）。SOS response产生一系列应急措施，如：系统修复能力增强，多达20种基因RecA、LexA、UVR等被激活，此外细胞分裂受到抑制。SOS修复系统（SOS repair system）是最早在大肠杆菌和相关细菌中发现的一个旁路修复系统。它不像重组修复那样可以越过损伤部位，而是使DNA聚合酶在受损伤部位继续完成复制。但是复制的完成是以保真性大大降低为代价进行的，因此在该修复后仍然有很多的错误，很可能导致无法完成正常的功能。 RecA蛋白除了参与重组修复外，当大肠杆菌DNA受到损伤及DNA复制受抑制时，RecA蛋白被激活，进而激发SOS response。LexA是一个小的蛋白质(22kD)，它在正常细胞中比较稳定，可以作为众多操纵子的阻遏物；同时LexA可被RecA激活。激活的RecA引起LexA的自我催化切割，进而解除对修复功能相关的操纵子的阻遏，使得DNA损伤得到快速修复。一旦修复完成，细胞恢复到正常状态，SOS途径的诱导信号解除，RecA表达降低，LexA还原高水平的表达状态以阻遏形式与DNA上20个碱基片段（SOS box）结合，并迅速关闭了SOS基因。可见SOS response是可逆的（图5-21）。 图5-21 LecA和RecA之间的拮抗关系（引自Benjamin 2006） 5.5 突变体的创制与应用 突变体是遗传学研究的重要材料，其表型与基因型是基因功能研究的直接证据，因此突变体的创制和特异突变体的筛选非常重要。已知突变体可分为自发突变和人工诱变。自发突变不足以满足现代遗传学研究的需要。诱发突变则可以利用人工的方法提高基因突变频率，在短时间内创制大量突变体，还可以获得许多在自发突变下