中华卵索线虫修改2.6资料.docVIP

中华卵索线虫（Ovomermis sinensis）DEAD-boxOsvbh-1的克隆与表达分析 王伟娜，曹梦西，赵娜娜，李神斌，周青春，王国秀* （遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室，华中师范大学生命科学学院，武汉430079） 摘要：通过同源克隆策略，克隆了中华卵索线虫（Ovomermis sinensis）DEAD-box家族基因Osvbh-1的全长cDNA序列。该基因全长2596 bp，含开放阅读框2237 bp，编码701个氨基酸，推导的氨基酸序列具有DEAD-box家族蛋白共有的保守结构域，与秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）vbh-1基因高度同源（80%）。荧光定量PCR分析结果显示，该基因可能为母源性基因；其表达量随着性腺成熟逐渐降低；推测该基因可能与中华卵索线虫生殖细胞的发育有关。 关键词：中华卵索线虫；DEAD-box；Osvbh-1；克隆；表达分析；生殖细胞 索科线虫（Mermithidae）是一宝贵的昆虫天敌资源，生防[1-2]。具有寄生期营养竞争压力决定其性别分化的特殊性别分化机制，即每一昆虫体内寄生的线虫越少，每条线虫所获得的营养就越多，其越有可能发育为雌虫，相反则为雄虫[3-4]。有关学者试图以体外培养的方法实现该线虫的产业化，以满足生物防治的需要，但未获最后成功，关键瓶颈问题是体外培养的线虫性别未分化成熟[5]。因此，对于中华卵索线虫性别分化机理的研究，一方面可以帮助解决体外培养中线虫性别未分化成熟问题，促进实现该线虫的商品化生产以满足生物防治的需要；另一方面作为营养竞争压力决定性别分化类型的典型代表，可以丰富性别分化机理的理论研究。目前关于该线虫性别分化机理的研究停留在形态学观察及生理生化成分分析上[]，对于功能基因及功能基因组等分子生物学研究至今还未见报道。 在研究中华卵索线虫的性别分化的过程中，拟解决的关键问题之一即确定线虫性别开始分化的关键时期。李俊莉（2006）等通过组织切片的方法从宏观角度观察到性腺发育起始于寄生后期幼虫蜕皮的阶段[8]，但该方法始终无法精确的确定该线虫生殖腺发育的起始时期。对于性别分化分子机制的研究，发育生物学基础是必不可缺的，如生殖细胞发生的时间以及迁移、转化的规律等，明确了这些，我们可以较为准确地掌握中华卵索线虫性别开始分化的临界时期，即关键期，才能通过更有效、简便的手段获得调控中华卵索线虫性别分化的关键基因，以及深入研究这些基因之间的相互作用，参照模式生物的研究成果，最终得到索科线虫的性别分化机制。 　DEAD-box 家族是一个ATP 依赖的RNA 解旋酶家族,广泛存在于细菌、酵母、植物和动物中[9-11] , 核心区内9 个保守的序列区共同决定了DEAD-box家族蛋白的ATP依赖的RNA解旋酶活性[12-13]，如图一所示。该家族是以其中一个保守域D-E-A-D（Asp-Glu-Ala-Asp）命名的[9,14]。DEAD-box家族的主要成员一般被分为VASA、PL10、 p68、eIF4A等亚家族[15-18 ]， VASA和PL10亚家族参与了生殖细胞发生的多个重要环节，其中PL10 基因最初在小鼠精巢中获得[15] ,其相关蛋白广泛存在于从酵母[19-20 ] 到植物[21] 和动物[15,2 2-26 ] 的真核细胞生物中,氨基酸序列高度保守，它们能结合DNA、RNA、ATP 等,具有依赖ATP的RNA解旋酶活性[15]。在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中存在VBH-1（Vasa and Belle-like helicase）[27]。 图1 DEAD-box家族保守结构域 本研究采用分子生物学的手段，通过同源克隆的方法，以与生殖细胞发育密切相关的DEAD-box基因家族为研究对象，首次在中华卵索线虫中获得了与秀丽线虫vbh-1基因高度同源的基因，并将其命名为Osvbh-1。 1 材料与方法 1.1 材料及试剂准备 中华卵索线虫怀卵雌虫于2001年3月采自河南省上蔡县农田，室温( 26士1℃)条件下孵化出感染期幼虫 (II期幼虫寄生前期幼虫) 后，在本实验室通过体内培养进行传代。收集胚胎发育期卵、期幼虫、寄生期幼虫、寄生后期幼虫雌雄成虫。总RNA提取试剂SV Total RNA Isolation System）购自公司，MLV 反转录酶ExTaqTM、p-T载体连接试剂盒胶回收试剂盒购自大连公司，SMARTRACE试剂盒购自Clontech公司，其余均为国产分析纯试剂。大肠杆菌DH5α由本实验室保存。’RACE 基因特异引物 5GSP ACGTCGATCAATCGCCCAGGAGTA 5NGSP CAAAATGGCGGATTGTATGGGCGT 3’RACE