普通PCR、原位PR、反向PCR和反转录PCR的基本原理和操作步骤.doc

普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的基本原理和操作步骤 基础兽医系 陈洪博 S座机电话号码 普通PCR 1概述聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction ，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶 简称Taq polymerase , 则是于1976年从温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与Saiki 等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。PCR原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火 复性 ：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR反应体系与反应条件标准的PCR反应体系 10×扩增缓冲液 10μl 4种dNTP混合物 200μl 引物 10～100μl 模板DNA 0.1～2μg Taq DNA聚合酶 2.5 μl Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水 100 μl PCR反应五要素参加PCR反应的物质主要有五种即引物 PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链 、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+ 。［PCR步骤］ 　　标准的PCR过程分为三步： 　　1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA 　　2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。 　　3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。 　　每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。 PCR反应特点特异性强PCR反应的特异性决定因素为： 　　①引物与模板DNA特异正确的结合； 　　②碱基配对原则； 　　③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； 　　④靶基因的特异性与保守性。 　　其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合 复性 可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。 灵敏度高 　　PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克 pg 10-12 量级的起始待测模板扩增到微克 μg -6 水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU 空斑形成单位 ；在细菌学