蛋白质的共价结构技术范本.pptVIP

蛋白质的共价结构 1.了解蛋白质对生物体的重要意义。 2.了解蛋白质的分类，掌握蛋白质元素组成的特点。 3 肽及肽键 4 蛋白质一级结构的测定 1.样品必需纯（ 97%以上） 2.知道蛋白质的分子量 3.知道蛋白质由几个亚基组成 4.测定蛋白质的AA组成并根据分子量 计算每种AA的个数 5.测定水解液中的氨量计算酰胺的含量 （一）蛋白质测序策略 1 测定蛋白质分子中多肽链的数目 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。 2 多肽链的拆分 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体。 可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链 亚基 。 3 断开二硫键 在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的?-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，防止重新被氧化。 4 测定每条多肽链的AA组成，并计算出AA成分的分子比 5 分析多肽链的N-末端和C-末端 6 多肽链断裂成多个肽段 采用两/多种不同的断裂方法将多肽 断裂成两套或多套肽段，并将其分离。 7 测定每个肽段的氨基酸顺序 8 确定肽段在多肽链中的次序 利用两/多套肽段的AA顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的AA顺序。 （二）、末端氨基酸残基测定 两类多肽链末端氨基酸残基： N-端氨基酸 C-端氨基酸 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。 ? 丹磺酰氯（DNS）法 ?苯异硫氰酸酯（PITC 法 ④氨肽酶法 肽链外切酶:从多肽链N-端逐个向里水解 根据不同反应时间测出释放的AA种类和数量， 按反应时间和AA残基释放量作动力学曲线 蛋白质N-末端残基顺序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶 —水解以Leu残基为N-末端的肽键速度最大。 ③羧肽酶法 肽链外切酶:从多肽链C-端逐个水解 根据不同反应时间释放出的AA种类和数量 蛋白质C-末端残基顺序。 四种羧肽酶：A,B,C和Y； A和B 胰脏 、C 柑桔叶 、Y 面包酵母 ∽A:除Pro/Arg/Lys/外所有C-末端AA残基 ∽B:只水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键 （三）、二硫键的断裂 盐酸胍/尿素解离多肽链间的非共价力。 应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。 （四）、氨基酸组成的分析 2、化学裂解法 ①溴化氰水解法 Cyanogen bromide ——选择性地切割由Met羧基形成的肽键。 3、肽段的分离纯化： 凝胶过滤、凝胶电泳和HPLC法 （六）、肽段氨基酸序列的测定 （七）、肽段在多肽链中次序的决定 重叠肽（overlaping peptide） 蛋白质一级结构测定的策略 1 测定蛋白质分子中多肽链的数目 2 多肽链的拆分 3 断开二硫键 4 测定每条多肽链的AA组成，并计算出AA成分的分子比 5 分析多肽链的N-末端和C-末端 6 多肽链断裂成多个肽段 7 测定每个肽段的氨基酸顺序 8 确定肽段在多肽链中的次序 9 确定原多肽链中二硫键的位置。 1、 末端分析 ? 二硝基氟苯（DNFB）法 ① 肼解法 肼化物可与苯甲醛缩合成不溶于水的物质 ② 还原法 2 C 末端分析 C末端AA α氨基醇 硼氢化锂 1、酸水解 2、碱水解 1、酶解法: 内切酶：胰蛋白酶、糜蛋白酶、 胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶 外切酶：羧肽酶和氨肽酶 多肽链的选择性降解 （五）、多肽链的部分裂解和 肽段混合物的分离纯化 R1 Lys（K）和Arg（R） 专一性较强，水解速度快 R2 Pro（抑制） 胰蛋白酶trypsin R1 Phe（F）、 Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AA Leu、Met和His稍慢 R2 Pro（抑制） pH8-9 糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin） 水解速度与相邻AA性质有关: 酸性：-/碱性：+ R2 Phe（F）、 Trp（W）、 Tyr（Y）、Leu（L）、Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性强的AA水解速度较快 R2 Pro或Gly，不水解 R1或R3 Pro，抑制水解 嗜热菌蛋白酶（thermolysin R1和/或R2＝Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、 Leu（L）及其它疏水性AA水解速度较快 R1 Pro（抑制） pH2 胃蛋白酶Pepsin 羧肽酶和氨肽酶 ②NH2OH断裂： 较专一性断裂Asn-Gly之间的肽键 Asn-Leu及Asn-Ala键也能部分断裂 N-端分析法特点：能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。 1、 Edman法 （