土壤微生物计数法.docVIP

土壤微生物计数法 ??? 土壤是最复杂、最丰富的微生物基因库，所含微生物不仅数量巨大，而且各类繁多，主要包括细菌、真菌和放线菌三大类，是土壤最活跃的成分。土壤微生物数量测定方法可分为三大类：一类是根据在培养基上生长的菌落数来计算土壤微生物的数量，统称为培养计数法，主要有稀释平板法和最大或然计数法；二类是将土壤微生物染色后，在显微镜下观察计数，称为直接镜检法，包括涂片法、琼脂薄片法和膜过滤法等；三类是直接将微生物从土壤中分离和提取出来后再进行测定，主要有离心分离法。 1.1培养计数法 1.1.1概要 在自然条件下，土壤中的大多数微生物处于休眠状态，一旦供给可利用的碳源（如培养基），一些微生物将快速生长繁殖。因此，根据在培养基上所生长的微生物数量，可以估算土壤中微生物的数量。这种土壤微生物数量测定方法称为培养计数法，主要包括稀释平板计数法（简称稀释平板法）和最大或然计数法。 稀释平板计数法的基本原理：土壤微生物经分散处理成为单个细胞后，在特殊的培养基上生长并形成一个菌落，根据形成的菌落数来计算微生物的数量。 最大或然计数法的基本原理：假设被测定的微生物在稀释液中均匀分布，并在试管或平板上全部存活，随着稀释倍数的加大，稀释液中微生物的数量将越来越少，直到将某一稀释度的土壤稀释液接种到培养基上培养后，没有或很少出现微生物菌落。根据没有出现菌落的最低稀释度和出现菌落的最高稀释度，再用最大或然计数法计算出样品中微生物的数量。 1.1.2稀释平板法 一、试剂配制 常用的培养基各类很多（见附录一），可根据需要测定的微生物种类选择培养基。按配方配制培养基后，先在121下灭菌15min，冷却至45～50使用。凝固后的培养基可加热溶解后使用。 二、仪器设备 广口瓶或三角瓶及配套的橡皮塞，移液管（1ml、10ml，吸口用棉花塞住后用牛皮纸包好灭菌）培养皿（9㎝，用牛皮纸包好后灭菌）和显微镜等。 三、操作步骤 （1）土壤系列稀释液制备 取新鲜土壤（＜2㎜）10.00g，放入经灭菌的装有70ml水的广口瓶中，塞上经灭菌的橡皮塞，在振荡机上振荡10min，此为10-1土壤稀释液。迅速用灭菌的移液管吸取10-1土壤稀释液10ml，放入灭菌的装有90ml水的广口瓶中，塞上橡皮塞，混合均匀，此为10-2土壤稀释液。再如此依次配制10-3、10-4、10-5和10-6系列土壤稀释液。上述操作均在无菌条件下进行，以避免污染。 （2）平板制备和培养 从两个稀释倍数的土壤稀释液中（细菌和放线菌通常用10-5和10-6土壤稀释液，真菌用10-2和10-3稀释液）吸取1.00ml（吸前摇匀），分别放入五套培养皿中（注意每变换一次浓度，须更换一支移液管）；再向培养皿内注入45～50的培养基10ml，立即混合均匀，静置凝固后，倒置放于培养箱中培养。细菌和放线菌在28下培养7～10d，真菌在25下培养3～5d。 （3）镜检计数 尽管使用不同的培养基，但细菌、放线菌和真菌都可能在同一个培养基上生长，所以必须用显微镜做进一步的观察。明显有菌丝的一般是真菌，真菌的菌丝为丝状分枝，比较粗大；而放线菌菌丝呈放射状，比较细。细菌有球状和杆状，有些细菌也形成细小的菌丝。酵母菌的菌落与细菌的菌落很相似，但在显微镜下容易分辨。酵母菌个体比较大，一般有圆形、椭圆形、卵形、柠檬形或黄瓜形，有些还有瘤状的芽。 在两级稀释度中，选细菌和放线菌的菌落数为30～200个、真菌菌落数为20～40个的培养皿各5个，取其平均值计算出每组的菌落数。如果菌落很多，可将其分成2～4等份进行计数。微生物生物量可以通过微生物细胞个体大小和密度计算得到。 （4）计算 土壤微生物数量（cfu·g-1）=MD/W 式中M为菌落平均数：D为稀释倍数；W为土壤烘干质量（g）。 1.1.3最大或然计数法（MPN） 一、试剂配制 培养基配制与稀释平板法基本相同，采用试管培养时，培养基中不需加琼脂。 二、食品设备 试管（2㎝×18㎝），其他同稀释平板法。 三、操作步骤 （1）土壤系列稀释液中制备 按稀释平板法制备土壤系列稀释液，一般配制10-1～10-6的稀释液。 （2）接种和培养 从上述土壤系列稀释液中各取1ml接种到平板培养基或试管液体培养基中，每个稀释度重复3～5次，同时设置空白对照，以检验是否被污染。因微生物类型和生长速度不同，所要求的稀释倍数、培养基和培养时间都有差别(表1-1)。根据微生物类型分别在28～30培养7～30d。培养结束时，记录出现菌落的平板数量或出现特征反应的试管数。 表1-1? 几种主要土壤微生物生理群MPN计数方法 ? （3）计算 通常将有微生物生长的最后3个稀释度中出现微生物菌落的平板数作为微生物生长指标，从最大或然数表中查出最大或然数近似值，按下列公式计算样品中的微生物数量： 土壤微生物数量（cfu·g-1