CALR基因突变在骨髓增殖性肿瘤中的临床研究.docVIP

CALR基因突变在骨髓增殖性肿瘤中的临床研究 　　[摘要] 目的 探讨经典的断裂点簇集区/Abelson白血病病毒（BCR/ABL）融合基因阴性骨髓增殖性肿（MPN）患者中钙网蛋白（CALR）基因突变的发生率，分析CALR基因突变阳性MPN的临床特点。 方法 依据2008年WHO造血组织和淋巴组织肿瘤分类标准对2012年1月～2015年3月在临沂市沂水中心医院就诊的72例临床初诊为“MPN”患者进行诊断时采用直接测序法检测CALR基因突变，采用等位基因特异性聚合酶链反应（AS-PCR）检测JAK2V617F突变。分析CALR基因突变阳性MPN的临床表现及实验室检查特点。 结果 在22例真性红细胞增多症（PV）患者中16例携带有JAK2V617F突变（突变率为68%），未检测出CALR基因突变；26例原发性血小板增多症（ET）患者中12例携带有JAK2V617F突变（突变率为46%），8例检测出CALR基因突变（突变率为31%），JAK2V617F突变阴性患者中CALR基因突变率为57%（8/14）；23例原发性骨髓纤维化（PMF）患者中11例携带有JAK2V617F基因突变（突变率为49%），8例检测出CALR基因突变（突变率为35%），JAK2V617突变阴性患者中CALR基因突变为为67%（8/12）。72例患者中均未检测到MPL515突变。 结论 CALR基因突变是JAK2V617突变阴性的MPN特异性分子标志物。将CALR基因突变检测纳入MPN诊断标准可以提高诊断的准确性减少漏诊率。 　　[关键词] 骨髓增殖性肿瘤； CALR基因；JAK2基因；突变 　　[中图分类号] R551.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）09（b）-0086-04 　　BCR/ABL1融合基因阴性的骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferative meoplasm，MPN）是一组起源于多能造血干细胞的恶性肿瘤，表现为骨髓细胞一系或多系过度增殖，包括真性红细胞增多症（polycythemia，PV）、原发性血小板增多症（essential thrombocthemia，ET）、原发性骨髓纤维化（primary myelofibrosis，PMF），临床上有发生动静脉血栓、髓外造血、骨髓纤维化、甚至向白血病转化[1-2]。JAK2V617F突变见于97%的PV，50%～60%的ET及PMF患者[3]。MPL515基因突变可见于3%～5%的JAK2V617F突变阴性的ET及PMF患者[4]。自2005年JAK2V617F和MPL515突变相继被发现并纳入WHO诊断标准，该突变的发现改变了MPN的诊断和分类，从分子的角度诠释了MPN的发病机制。但仍有40%的ET及PMF患者未检测到JAK2V617F基因突变，最近研究发现CALR见于JAK2V617F阴性的ET及PMF患者，本研究对临床初诊MPN患者进行了JAK2V617F、CALR及MPL515基因突变分析，现报道如下： 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 　　选择2012年1月～2015年3月在临沂市沂水中心医院就诊的72例初诊MPN患者。其中PV23例，男11例，女12例，年龄38～72岁；ET26例，男12例，女14例，年龄25～80岁；PMF23例，男16例，女7例，年龄39～76岁。所有患者均经医院伦理委员会批准并签署知情同意书。 　　1.2 检验指标 　　对患者临床资料、骨髓和外周血涂片、骨髓活检进行分析，按照WHO造血和淋巴组织肿瘤分类标准（2008）进行诊断。 　　1.3 方法 　　CALR基因突变分析：用血液基因组DNA提取试剂盒（QIAamp DNA Mini Kit，生产商：Qiagen公司）提取骨髓细胞基因组DNA，CALR9号外显子PCR扩增引物（生产商：Invitrogen公司；使用浓度：5.0 pmol/μL；贮存条件：干粉于-20℃保存，工作液于4℃保存；有效期：-20℃为1年，4℃为半年），设计序列：引物名称：CALR-X9-Fwd，引物序列：FAM-CTGGTCCTGGTCCTGATGT；引物名称：CALR-X9-Rev，引物序列：TCTCACAGAGACATTATTTGGC。PCR体系包括DNA 50～100 ng，2×Taq PCR Master Mix（TIANGEN公司产品）15 μL，正反向引物各0.5 μL，加去水离子补足体系至30 μL。反应条件：98°C预变性3 min，98°C变性10 s，63°C退火30 s，72°C延伸30 s，共29个循环，72°C延伸5 min。PCR扩增产物经回收、纯化后实验数据采用片段分析软件Genemapperid V4.1进行分析，分析示例