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HIF―1α基因多态性与肝癌的相关性 　　【摘要】目的检测肝癌病人与正常人HIF-1α基因的多态性。方法对121例肝癌病人和100正常人运用SnapShot 技术检测HIF1A基因（rs2301104、rs8005745、rs2301113、rs2057482）这4个位点的表达。结果肝癌病人与正常人的HIF-1α基因（rs2301104、rs8005745、rs2301113、rs205748）这4位点的表达P0.05.结论HIF-1α基因多态性与肝癌无一定的相关性 　　肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，世界范围内，肝癌的率与死亡率分别为恶性肿瘤的第5位和第3位。每年全球发病率逐年增长，已超过65万/年， 而我国发病人数约占全球的56%；在肿瘤相关死亡中仅次于肺癌，位居第二。因此，肝癌的高发病性与高致死性对威胁我国人民健康和生命财产造成严重的威胁.目前已证实HIF-1α基因表达的HIF1A蛋白与肝癌有密切的相关性，不仅在促进肝癌的发生，发展中起一定的作用（参考文献1，3，4），而且HIF-1α可作为评估肝癌淋巴结转移和预后的重要指标之一（参考文献5），另有报道证实HIF-1α有望成为评价及逆转肿瘤多药耐药的新指标（参考文献2与6）。为了进一步了解HIF-1α基因具体哪个与肝癌发生，发展最为密切相关，本实验运用SnapShot 技术深入研究HIF-1α基因多态性（rs2301104、rs8005745、rs2301113、rs2057482）与肝癌发生的相关性。 　　1 材料与方法 　　1.1研究对象 　　本实验选取 2008 年至2012 年在浙江大学附属第一医院肝胆胰中心住院的手术患者，经实验室及影像学等检查，临床诊断为原发性肝癌，行原发性肝癌根治手术，所有患者皆经术后病理明确诊断为肝细胞癌，121例原发性肝细胞肝癌病人的外周血标本，其中男性73 名，女性48名，年龄28岁至71岁，平均45.3岁，HBsAg阳性115例，阴性6例；AFP阳性87例，阴性34例。对照组100例均来自2010年3月～2012年4月间，在浙江大学附属第一医院采集的体检正常人静脉血样。体检结果均正常，无肝硬化、乙肝相关病史、糖尿病等疾病，且一级亲属无HCC病史。其中男性56 名，女性44名，年龄21岁至69岁，平均39.4岁，HBsAg，AFP均阴性。研究对象均有完整的临床资料，均签署知情同意书。 　　1.2DNA提取 　　运用Promega maxwell@16机器提取DNA，大约40 分钟后，提取DNA 程序完成。将收集管中大约210μl 的DNA 溶液转移至冻存管。冻存管在-80℃冰箱保存 　　1.3HIF-1α基因的多态性分析 　　运用SnapShot 技术进行HIF-1α基因的多态性分析。 　　1.3.1 PCR反应体系及反应条件 反应体系：（20μl）包含1x HotStarTaq buffer， 3.0 mM Mg2+， 0.3 mM dNTP， 1 U HotStarTaq polymerase （Qiagen Inc.） 和 1 ?l 样本DNA。 反应条件：95?C 2min； 11 cycles x （94?C 20s， 65?C-0.5?C /cycle 40 s， 72 ?C 1min30s）； 24cycles x （94?C 20s， 59?C 30s， 72 ?C 1min30s）； 72?C 2 min； 4 ?C for ever 　　1.3.2 PCR产物纯化 在15μl PCR产物中加入5U SAP酶和2U Exonuclease I酶，37 ?C温浴1小时， 然后75?C灭活15分钟 　　1.3.3 SNaPshot多重单碱基延伸反应 　　1.3.4 延伸产物上ABI3730XL测序仪 取0.5μl 纯化后的延伸产物，与0.5μl Liz120 SIZE STANDARD， 9μl Hi-Di 混匀， 95 ?C变性5分钟后上ABI3730XL测序仪，收集的原始数据用 GeneMapper 4.1 （AppliedBiosystems Co.， Ltd.， USA） 来分析。 　　1.4结果 　　实验结果数据显示HIF-1α基因多态性（rs2301104、rs8005745、rs2301113、rs2057482），他们的位点等位基因频率比较差异无统计学意义（P0.05）。经这些位点的共性，特性分层后分析差异扔无统计学意义（P0.05）（表1）（表2）（表3）（表4） 　　HIF1A基因rs2301104位点肝癌组与正常组的对比（表1） 　　1.5 讨论 　　缺氧诱导因子-1 ，即低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）