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HPV58型E67融合基因腺病毒载体构建 　　摘要：目的：构建HPV58亚型E6-E7融合基因腺病毒载体，并制备HPV58亚型E7基因多克隆抗体。 方法：通过RT-PCR和PCR技术从宫颈癌病人活检组织总RNA中扩增HPV58E6和E7基因片段，去除E6终止密码子和E7起始密码子，连入过渡质粒pCDNA3.1（-），形成HPV58E67融合基因， 扩增E67融合基因片段后连入T载体，应用Takara MutanBEST Kit试剂盒定点突变HPV58E67基因去转化活性后再连接到穿梭质粒pshuttle2，构建腺病毒载体。 结果：成功构建HPV58E67融合基因腺病毒载体 。结论：近一步研发对人体行之有效的HPV16，18，58三价治疗性疫苗打下基础 　　关键词：人乳头瘤病毒HPV58亚型;E6-E7融合基因;腺病毒载体;定点突变 　　高危型人类乳头瘤病毒（HPV）感染是诱发宫颈癌的首要启动因素。目前临床宫颈癌传统方法疗效不佳，因此近10年来HPV疫苗研究非常活越。研究表明，高危型HPV16，18感染宿主细胞后，整合后的HPV DNA的早期开放阅读框架E2、E6和E7基因是发生致癌作用的主要基因。根据我国HPV感染亚型的分布特点，本实验选择HPV16、18、58这三个最常见的亚型（涵盖国内80%以上的宫颈癌HPV感染病例，东南部比例更高）中的58亚型，构建了其E6-E7融合基因，通过定点突变方法去除转化活性后重组入腺病毒载体，为下一步获得对人体行之有效的HPV16，18，58三亚型治疗性候选疫苗打下基础。 　　1材料和方法 　　1.1模板、菌株和载体 　　HPV58基因组全长由自行扩增宫颈癌患者活检组织（由深圳市中医院检验科提供）获得。中介质粒载体pMD18T Simple购自TaKara。pCDNA3.1（-），Adeno-X腺病毒载体系统（BD Clontech），含pShuttle2及pAdeno-X质粒，Pet28a质粒等，由清华大学深圳研究生院黄来强教授实验室惠赠。 　　1.2主要试剂 　　限制性内切酶I-ceuI、PI-SceI、PacI、SwaI购自NEB公司，其余各种工具酶，点突变试剂盒，DNA及点突变试剂盒购自Takara公司。小鼠抗人HPV 58E7单抗购自GeneTex公司，小鼠抗人HPV单抗购自Santa Cruz公司，HRP标记的羊抗小鼠IgG及化学发光检测试剂购自上海华美生物公司，LipofectamineTM2000脂质体转染试剂盒购自Gibco。 　　1.3 HPV58E67基因的获取 　　Trizol法提取组织总RNA， RT-PCR扩增获得HPV58开放阅读框全长， 根据GeneBank中公布的HPV58亚型E6，E7基因序列设计扩增引物，PCR扩增HPV58亚型E6，E7基因，PCR产物经纯化，去除E6终止子、E7启动子，酶切后按设计的酶切位点，连接过渡质粒pCDNA3.1（-）并形成融合基因，转化DH5α感受态细胞，挑取阳性质粒酶切鉴定并送上海英骏公司测序。 　　1.4 突变引物的设计与合成 　　根据 HPV58基因序列和实验目的设计扩增突变引物（表1），由上海英骏公司合成 　　表1 引物设计 　　1.5 目的基因的扩增、突变及重组腺病毒载体构建 　　上述构建的重组质粒PCR扩增E67融合基因，PCR产物纯化后连接pMD18T Simple， 将上一步回收的DNA片段用Takara Ligation Mixture连入质粒pshuttLe2NheⅠ和XbaⅠ位点之间，将重组pshuttLe2质粒分别以内切酶PI-SceI和I-CeuI进行双酶切，回收的DNA片段用Takara Ligation Mixture连入质粒Adeno-X，连接产物用SwaI酶切后转化DH5，PCR，酶切鉴定，并送上海英俊公司测序。 　　1.6外源蛋白表达鉴定 　　PacI酶切线性化pAdeno-X DNA，脂质体转染HEK293细胞，常规37℃、5%CO2继续培养至细胞出现明显病态效应后，常规Trizol法提取细胞蛋白，以小鼠抗人HPV（含58型）单抗为一抗，HRP标记羊抗鼠IgG为二抗，Western Blotting分析外源基因表达情况。 　　2结果 　　2.1 HPV58E67基因的获取 　　PCR扩增V58E6，E7基因，结果（图1）与预期一致，测序结果与GenBank中公布的相应序列（NC001443）比对完全一致。产物经纯化，E6终止子、E7启动子去除，按设计的酶切位点连接DNA3.1（-）成过渡质粒，对过渡质粒进行酶切鉴定，得到5.4kb大小的载体片段和约800bp的目的片段，鉴定结果如图2，提示过渡质粒构建成功。 　　 　　图1 M为Mark