结肠癌组织IL―10和IFN―γ mRNA的表达及其临床意义.docVIP

结肠癌组织IL―10和IFN―γ mRNA的表达及其临床意义 　　【摘要】 目的：研究结肠癌组织白细胞介素-10（IL-10）和干扰素-γ（IFN-γ）的基因表达及其相关的启动子区甲基化状态。方法：随机选取2011年1月-2014年6月80例结肠癌患者组织为结肠癌组、80例相应癌旁组织为癌旁组和100例正常健康者结肠组织为对照组。采用亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性PCR和实时荧光定量PCR检测对IL-10和IFN-γ基因的甲基化状况进行检测，分析其与结肠癌主要临床特征之间的关系。结果：三组组织的IL-10和IFN-γ mRNA 水平之间比较，差异均有统计学意义（P癌旁组对照组，差异均有统计学意义（P0.05）。结论：IL-10和IFN-γ基因启动子区甲基化状态影响其在结肠癌组织中的表达，结肠癌患者处于TH2极化状态，与结肠癌发生发展密切相关。 　　【关键词】 结肠肿瘤； DNA甲基化； 组织； 干扰素-γ； 白细胞介素-10 　　结肠癌患者机体内免疫微环境的变化已经受到人们的重视，其中辅助性T细胞（Th）亚群Th1/Th2的失衡在恶性肿瘤免疫逃逸与免疫耐受中非常重要[1]。在哺乳动物细胞基因组中，约有3%～5%的胞嘧啶被甲基化，基因甲基化异常与结肠癌变化密切相关[2]，因此制定结肠癌Th1、Th2相关细胞因子DNA甲基化谱对结肠癌的早期诊断有重要意义。本文通过检测结肠癌患者结肠组织中Th1/Th2型细胞因子白细胞介素-10（IL-10）和干扰素-γ（IFN-γ）基因启动子区甲基化状态及转录活性，旨在探讨DNA甲基化与基因表达的关系及其在结肠癌中的作用，为结肠癌的诊断和治疗提供新的靶点。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 随机选取2011年1月-2014年6月本院住院部就诊的80例结肠癌患者组织为结肠癌组、80例相应癌旁组织为癌旁组和100例正常结肠组织为对照组。结肠癌患者年龄34～75岁，中位年龄49岁，男55例，女25例，病理类型均为鳞癌，根据WHO标准分级[3]，高分化鳞癌14例，中分化鳞癌42例，低分化鳞癌24例。对照组32～75岁，中位年龄49岁。收集三组患者的结肠组织标本，其中对照组标本来源于结肠息肉组织，结肠癌组标本来源于结肠活检和手术治疗，癌旁组标本来源于结肠癌旁组织手术，结肠癌患者所有手术标本均经过本院病理学专家明确诊断，在患者手术中取病理标本，标本放入液氮中速冻后-80 ℃条件下保存待检，样本获得了伦理委员会批准并签署知情同意书。 　　1.2 方法 　　1.2.1 目标标本相关的DNA和RNA提取 均按试剂盒说明书提供的方法提取三组结肠组织DNA与RNA，并采用琼脂糖凝胶电泳并鉴定DNA和RNA完整性。 　　1.2.2 IL-10和IFN-γ基因启动子区甲基化检测 按照EZ DNA Methylation-GoldTM Kit试剂盒（购自美国Zymoresearch公司）操作说明对DNA进行甲基化修饰及纯化。在NCBI线上检索IFN-γ（J00219）和IL-10（AF418271）基因启动子区序列，Methyl Primer Express V2.0软件进行分析核对参考物[4]，亚硫酸氢盐测序法（BSP）检测IL-10基因启动子。基化特异性PCR（MSP）检测IFN-γ基因启动子区非甲基化及甲基化基因，IL-10和IFN-γ基因启动子区序列一甲基化特异性PCR和RT-PCR 引物序列如表1所示。基化结果判断：出现甲基化特异性引物扩增产物判断定为甲基化，仅非甲基化特异性引物扩增产物判断定为非甲基化。 　　1.3 统计学处理 数据采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料以 （x±s）表示，采用t检验，计数资料采用 字2检验，P0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 三组结肠组织IL-10和IFN-γ mRNA的表达比较 三组IL-10和IFN-γ mRNA 水平比较，差异均有统计学意义（P0.05），其中结肠癌组和癌旁组IL-10 mRNA均高于对照组（P0.05），IFN-γ mRNA均低于对照组（P0.05），结果见表2。 　　2.2 三组IL-10和IFN-γ基因启动子区甲基化率比较 三组结肠组织IL-10基因启动子区-320、-350、 　　-352、-373位点甲基化率进行相互比较，差异均无统计学意义（P0.05）；三组结肠组织基因启动子区-110、-185位点甲基化率进行相互比较，差异均有统计学意义（P癌旁组对照组，差异均有统计学意义（P0.05），结果见表3；三组结肠组织提取DNA的IFN-γ基因启动子区甲基化状态见电泳图1。 　　2.3 IL-10基因启动子区 通过在线的TFSEARCH软件分析发现，IL-10基因启动子区包含