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基于园林植物的SSR标记开发及应用研究进展 摘要：通过查阅文献，笔者对目前SSR引物开发方法以及SSR标记在园林植物上的应用做了综合分析，并对目前SSR标记在园林植物上的应用存在的问题及前景做了展望，研究结果为了解SSR标记在园林植物的研究现状及利用SSR标记研究园林植物提供了理论依据。 关键词：SSR引物；园林植物；研究进展 SSR（Simple Sequence Repeat）即微卫星（Mi-crosatellite）在基因组中分布广泛。每个DNA序列均由1～6个核苷酸串联而成，因其不同的重复次数和重复程度使每个点位呈现多态性。SSR序列两端是相对稳定的序列，因此可根据两端序列设计出特异引物，并对DNA进行扩增，将扩增片段长度的多态性用于分子标记。SSR分子标记因其丰富的多态性、良好的重复性和共显性等优点，是园林植物品种检测、遗传图谱构建、研究群体遗传结构、及分子标记辅助育种的理想工具。相对于农作物、园艺作物和微生物等，SSR标记在园林植物中应用较少。为此，笔者通过查阅近几年国内外文献，综述了SSR引物开发及在园林植物中的应用进展，旨在了解SSR标记在园林植物中的应用现状，为以后利用SSR标记研究园林植物提供理论依据。 1 园林植物SSR引物开发方法研究进展 近年来，SSR引物开发研究进展迅速，开发方法较为多样，笔者通过查阅文献，发现目前在园林植物中常用的SSR引物开发方法主要由以下4种，现对4种方法的原理及应用进行介绍。 1.1 经典方法 该方法是利用含微卫星序列的探针与事先已建立的基因文库杂交，筛选出阳性克隆测序，再根据SSR两侧的序列设计引物。具体操作又分2种：一是筛选出大插入片段基因组文库纯化出和探针有较强信号的克隆，分成亚克隆，再次杂交筛选出含有重复序列的克隆。该法有2个较为明显的缺点：一是对相对较大的克隆测序困难；二是要进行多次杂交才能达到要求，工作量较大。针对该缺点，研究人员想出了第2种方法，即筛选小片段基因组文库法。先将基因组DNA用酶切成200～1500bp的小片段，或用超声波将其处理成200～600bp的相对更小的片段，再用Klenow片段把它补平，构建成小片段基因组文库。其缺点在于测序容易，但SSR阳性克隆获得率很低，成功获得引物的机率就更低。Tokuko等在研究东南亚热带雨林树种龙脑香科植物Shoreacurtisii时，最初就是用这种方法。 1.2 富集法 富集法通常采用含有重复序列的寡核酸引物对基因组DNA进行扩增，然后对扩增片段进行克隆测序获得SSR序列，再设计引物。该方法避免了经典方法分离SSR位点大量、长时间的阳性克隆的筛选和基因组文库构建过程。根据具体操作方法可分为： 1.2.1 引物富集法。引物富集法即用含有SSR的PCR引物进行PCR富集。该法通常使用同目的微卫星重复互补的寡核酸作为引物，在基因组文库构建前后通过PCR反应富集微卫星点位。如Elaine以狗的基因组DNA为材料，采用传统方法先获取一个小插入片段的基因文库，然后用5′磷酸酸化核苷酸（CA）n进行引物PCR，经连接、转化，获得一个含（CA）n的标记选择库，即富集文库。随机挑选单克隆培养后转膜，杂交，再次筛选，得到的结果40%～50%都是强阳性克隆，比传统方法效率提高了50倍。 1.2.2 杂交富集法。杂交富集法是近年来较为广泛使用的方法，其中最具代表性的为磁珠富集法和尼龙膜法，2种方法的主要区别在于探针杂交介质的不同。如磁珠富集法基本原理是先用生物素对重复序列探针标记，然后与DNA酶切片段杂交，再利用生物素与链亲和素亲和性强的特性，用包被链亲和素的磁珠进行磁力吸附完成重复序列目标片段的富集，富集后获得有效重复序列片段效率大幅提高。Giovannim用11个微卫星重复探针从Saccharum spp中筛选微卫星点位，富集效率提高了40%左右。彭镇华等利用该方法开发了毛竹SSR标记引物。 1.3 省略筛库法 省略筛库法是为了提高有用SSR序列得率而出现的多基因座SSR分离标记法。其原理是用5′锚定简并SSR引物对基因组DNA进行扩增。具体操作过程是：以基因组DNA为模板，用5′锚定简并SSR引物来扩增，得到的产物连进T-载体，克隆后直接测序。扩增基因组DNA得到的PCR产物至少含有2个微卫星序列，每个都能保持原有的长度，可获得多态性更为丰富的SSR座位，且许多单基因座SSR标记仅用1个特异引物就可以扩增，降低了微卫星的开发成本。2001年，Hayden和Sharp在5′锚定PCR技术的基础上，发明了2种新的分离SSR标记的方法。一种是STMP（Sequence Tagged Microsatellite Profiling），该法是5′锚定PCR与基因表达的系列分析（SAGE）2种技术相结合的产物。其原理是应用5′锚定PCR获