基于液相色谱―质谱联用技术的多囊卵巢综合征患者血清脂质组学分析.docVIP

基于液相色谱―质谱联用技术的多囊卵巢综合征患者血清脂质组学分析 　　摘 要 多囊卵巢综合征是育龄期妇女最为常见的内分泌以及代谢紊乱疾病，是女性不孕的主要原因之一。多囊卵巢综合征患者临床存在很大的异质性，其致病机理尚未完全阐明。本研究基于反相液相色谱与串联四级杆飞行时间质谱联用技术（RPLC/Q-TOF-MS），对74例多囊卵巢综合征患者和54例正常女性的血清进行了脂质组学分析，定性鉴别出15类314种脂质化合物。数据采用非参数检验寻找潜在的差异化合物， p0.05为显著性差异。结果表明：多囊卵巢综合征患者与正常人相比，不饱和脂肪酸、部分鞘磷脂、甘油二酯、甘油三酯呈上调趋势； 部分磷脂酰胆碱、溶血性磷脂酰胆碱、溶血性磷脂酰乙醇胺呈下调趋势。而肥胖多囊卵巢综合征患者与非肥胖多囊卵巢综合征患者相比，不饱和脂肪酸、鞘磷脂、甘油二酯、甘油三酯上调更为明显； 溶血性磷脂酰胆碱、部分磷脂酰胆碱下调更为明显。本研究结果表明，脂质组学是研究疾病分型的有效手段。 　　关键词 多囊卵巢综合征； 液相色谱-质谱联用； 脂质组学； 脂质代谢异常 　　1 引 言 　　多囊卵巢综合征（Polycystic ovarian syndrome，PCOS）是女性不孕的主要原因之一，在育龄妇女人群中的发病率为6%～10%[1]。PCOS主要临床表现为月经稀发、慢性无排卵、卵巢多囊性改变，以及多毛症和黑棘皮症等，严重影响患者的身心健康。PCOS具有非常大的异质性，给诊断带来困难。Zhao等[2]用代谢组学方法探讨了代谢标志物进行PCOS辅助诊断的可能性。 　　脂质组学是研究生物体内脂质代谢变化以及脂质调控在生命活动中作用的有效手段[3]。液相色谱-质谱联用技术是目前主要的研究方法，反相液相色谱法由于柱效高、分离效果好，被广泛应用于脂质分析中。Hu等[4]将反相液相色谱法应用于p53突变的小鼠血浆研究中，各类脂质均得到了良好分离，线性特性和检测限也令人满意。 　　血脂代谢异常是PCOS患者的临床表现之一，主要表现为甘油三酯、总胆固醇、极低密度脂蛋白升高和高密度脂蛋白降低[5]。但是目前尚没有针对PCOS患者血清的脂质组学研究。本研究采用反相色谱与质谱联用（LC-MS）的脂质组学方法，对PCOS患者血清进行了脂质组学研究，希望发现PCOS患者的差异脂质化合物，为了解患者脂质代谢特征提供帮助。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　采用AcquityTM UPLC 液相色谱仪（美国Waters公司）与5600质谱仪（美国AB SCIEX 公司）联用进行脂质组学分析。分别使用正负离子扫描模式对样本进行检测，色谱柱为ACQUITY UPLC C8柱（10 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国Waters公司）。 　　甲醇、乙腈（HPLC级，Merck公司）； 乙酸铵（HPLC级）、 内标脂肪酸FFA 16-d3和FFA 18-d3（Sigma公司）； 磷脂酰胆碱PC 38∶0、磷脂酰乙醇胺PE 34∶0、溶血性磷脂酰胆碱LPC 19∶0、鞘脂SM 12∶0、甘油三酯TAG 45∶0和神经酰胺Cer 17∶0（美国Avanti Polar Lipids公司）。实验用水为超纯水（Milli-Q，美国Millipore公司）。 　　2.2 血液样本采集 　　采用黑龙江中医药大学附属第一医院妇科门诊和哈尔滨医科大学第一医院体检中心提供的74例PCOS患者血样和54例正常女性血样。研究经过黑龙江中医药大学附属第一医院机构伦理委员会批准，所有患者都签署了知情同意书。按照2003年鹿特丹会议提出的排除性标准[6]，在排除了先天性肾上腺皮质增生、库欣综合征等疾病之后， 满足下列3条标准中的两条即可诊断为PCOS： （1） 稀发排卵或者不排卵； （2） 高雄激素血症或高雄激素临床表现； （3） 卵巢多囊性改变。 　　正常人在生理月经周期第3～5天采血，PCOS患者在生理月经周期或者孕激素降低第3～5天或者两侧卵巢均无优势卵泡时采血。所有采样对象在前一天避免剧烈运动，于次日早晨采血。血样采集后静置30 min，离心后取血清置于-80℃保存。 　　根据身高体重指数（BMI），将74例PCOS患者和54例正常女性又分为肥胖组（BMI23）和非肥胖组（BMI≤23），即4组：非肥胖正常组（36例）、肥胖正常组（18例）、非肥胖PCOS组（39例）、肥胖PCOS组（35例）。 　　2.3 样本预处理 　　配制含内标的甲醇溶液，内标质量浓度分别为：PC 38∶0为0.67 μg/mL，PE 34∶0为0.33 μg/mL，LPC 19∶0为0.33 μg/mL，SM 12∶0为0.17 μg/mL，TAG 45∶0为0.53 μg/mL，Cer 17∶0为