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藏羊DQB1基因RT―PCR扩增及序列分析 　　摘要：提取藏羊脾脏总RNA，设计DQB1基因引物并进行反转录，扩增产物测序后利用生物软件进行序列分析。结果表明，藏羊DQB1基因长度为786 bp，编码261个氨基酸。藏羊DQB1基因与参考美利奴羊DQB1基因、中国美利奴细毛羊MHCⅡ抗原基因、山羊DQB1基因的核苷酸序列同源性依次为95.8%、95.9%、95.3%，氨基酸序列同源性依次为91.2%、92.0%、91.2%。 　　关键词：藏羊；DQB1基因；RT-PCR；序列分析 　　中图分类号：Q75；S826.8+3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）15-3784-02 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.15.053 　　Abstract： Total RNA from spleen of Tibetan sheep was extracted and reverse transcribed， and primers of DQB1 gene were designed for PCR amplification. Moreover， the gene sequence was analyzed by DNAStar software after the PCR products was sequenced. The results showed that the length of DQB1 gene was 786 bp， encoding 261 amino acids， and compared with DQB1 gene of Merino sheep， MHC Ⅱantigen gene of Merino Fine-Wool sheep and DQB1 gene of goat， the nucleotide sequence homology of Tibetan sheep were 95.8%， 95.9%， 95.3% respectively， and the amino acid sequence homology were 91.2%， 92.0%， 91.2% respectively. 　　Key words： Tibetan sheep； DQB1 gene； RT-PCR； sequence analysis 　　藏羊是中国三大原始绵羊品种之一，青海是主产区，分为高原型、山谷型和欧拉型。藏系绵羊具有耐粗饲、抗病力强等优良种质特性[1]。绵羊的主要组织相容性复合体（Major histocompatility complex，MHC）是参与机体免疫应答的重要基因[2]，分为Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类分子，其中MHC Ⅱ类分子的DRB和DQB基因编码产物在免疫系统中发挥重要的调控作用[3]。Sauermann等[4]研究表明MHC-classII Mamu-DQB1基因可以减缓猴免疫缺陷病毒（SIV）感染猕猴的速度。绵羊MHC-DQB1基因的遗传多态性与绵羊疾病相关，如多浪羊基因单倍型DQB1-DF和DQB1-DH与包虫病的抗性相关[5]，MHC在抗病育种显现出重要作用[6]。因此，本研究通过RT-PCR对藏羊DQB1基因进行扩增并对DQB1基因进行序列分析，旨在为青海藏羊遗传资源开发和抗病育种提供参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 脾脏 采自青海高原型藏羊，液氮速冻， -80 ℃冰箱中保存备用。 　　1.1.2 主要试剂 EASY spin Plus组织/细胞RNA快速提取试剂盒为北京艾德莱生物科技有限公司产品；Prime Script反转录酶、Ex Taq DNA聚合酶、 DL 2 000 DNA Marker为宝生物工程（大连）有限公司产品。 　　1.2 方法 　　1.2.1 引物设计 根据NCBI登录的绵羊DQB1基因序列，设计藏羊DQB1基因引物，目的基因长度为786 bp。引物序列如下：DQB1-F：5′-ATGTCTGGGA 　　TGGTGGCTCTGC-3′，DQB1-R：5′-TCAGCGCACAA 　　GCCCCTTCT-3′。 　　1.2.2 总RNA的提取 液氮中研磨脾脏成细粉后，后续步骤按试剂盒说明书依次进行。 　　1.2.3 反转录 按照Prime Script反转录试剂盒说明书依次进行。 　　1.2.4 DQB1基因的扩增 PCR反应体系：PCR Buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，DQB1-F 1 μL，DQB1-R 1 μL，cDNA 3 μL，Ex Taq DNA聚合酶0.5 μL，灭菌水35.5 μL。PCR扩