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肌酸水解酶分子水平 菌液的制备 培养基配方（1L）:肌酐5g、蛋白胨5g、硫酸镁（七个水）0.5g、磷酸氢二钾1g、氯化 钾5g，pH7.0。 将菌体接种于液体培养基中，28℃温室，摇床培养20h。 DNA的提取（步骤同链霉菌的DNA提取） 1、取2-3ml摇好的菌液，12000rpm离心，倒掉上清，加入500μl的lysis buffer 含溶菌 酶5mg/ml 。涡旋混匀，37℃温浴20min。 2、加入60μl 10%SDS轻轻颠倒混匀，70℃水浴15min，会变澄清。 3、加入5M的NaCl 200μl轻轻混匀。 4、加入200μl的苯酚，轻轻混匀之后，再加入200μl氯仿，混匀。12000rpm，离心10min。 5、用枪头将上层轻轻吸取至新的EP管中（防止吸到中间层），加入等体积的异丙醇， 混匀，会有大团的DNA出现，用枪头将其挑出来至新的EP管中，若DNA量少，离 心收集沉淀。 6、沉淀加入200μl 70%乙醇洗涤，12000rpm，2min。 7、将上清倒掉，EP管抽真空将残留的液体抽干，加入一定量的水溶解，加RNaseA 终 浓度50μg/ml ，37℃温育30min后取出，-80℃保存。 凝胶电泳分析 将提取的DNA凝胶电泳分析（点样2ul） PCR（退火温度，梯度为50~60℃，找出最适退火温度） PrimeStar反应体系：（略 KOD反应体系：（略） 凝胶电泳分析：图略 结果分析：失败 粗酶的提取（超声波法） 粗酶的提取方法： （1）乙二胺四乙酸二钠一磷酸氢二钾 EDTA-Na2-K2HPO4 缓冲液称取EDTA—Na2?2H2O 1．395 g，K2HPO4?3 H2O 5．392 g，加去离子水溶解后定容至1 000 mL，调 pH至 7．50，加入叠氮钠 NaNs 500 mg。 2 菌体洗涤收集摇瓶培养菌液，用 Heraeus厂 生产 的 Biofuge StrRtvs全能型高性能台式冷冻离心机离心 9 000 r／min，4~6℃，10 min ，弃上清，将菌块用30 mL冷去离子水洗2次，再用30 mL冷缓冲液洗一次 均需搅散菌块，离心 , 称细菌湿重 准确到mg 。 3 破碎菌体及脲酶粗提物的制备 用每1g湿菌10 mL冷缓冲液将收集的菌块搅散倾入小烧杯中，每1 g湿菌加入溶菌酶 2万U／mg 6 mg，室温下不时搅动，作用20 min，脱气胆酸钠 40mg／ml 0．3mL搅匀，放数分钟，用JY92一I型超声细胞粉碎机裂菌 作用30 s，间隔30 s，共12次 。低温离心收集上清液即为脲酶粗提物 。 测酶活 肌酸酶（肌酸脒基水解酶，Creatine amidinohydrolase）活性测定反应原理： 肌酸在肌酸酶的催化下水解成肌氨酸和尿素，尿素与对-二甲基苯甲醛在酸性条件子下作用产生黄色染料，黄色染料的生成量与肌酸酶的活性成正比关系。在435nm处测定黄色染料的吸光度，根据该黄色染料的毫摩尔吸光度系数为0.321，即可计算出黄色染料的生成量。 单位定义：在下述条件下，产生1μmol/min黄色染料为1单位。 试剂配制： 0.1mol/L肌酸溶液（以50mmol/LPBS新鲜配制）；对-二甲基苯甲醛溶液（溶2g对-二甲基苯甲醛于100ml二甲基亚中，然后加浓盐酸15ml。 测定程序: 1、吸取0.9ml肌酸溶液于试管中，37℃平衡约5min； 2、加入0.1ml待测酶液，混合，37℃温育10min； 3、加2ml对-二甲基苯甲醛溶液终止反应，25℃温育20min； 4、在435nm处水调零，测其吸光值。 注：空白管先加2ml对-二甲基苯甲醛溶液再加0.1ml待测酶液，其余步骤同测定管。 硫酸铵分级沉淀蛋白质： 将破胞得来的酶液离心沉淀，取上清，弃沉淀，向酶液中加入饱和硫酸铵至硫酸铵浓度为40%，4℃静置4h。离心沉淀，取上清弃沉淀，继续加入饱和硫酸铵至其浓度为60%，4℃静置4h。弃上清，取沉淀，加入磷酸缓冲液溶解。 蛋白质的纯化 将硫酸铵沉淀得来的蛋白质取2ml加入层析柱，层析。（10min、2ml、100支试管） 测酶活：利用酶标仪将层析收集的100支样液，弃前五管支利用分光光度计测酶活，看是否有酶活）取剩下的95支，并做好标记1-95，利用酶标仪测其酶活（原理及方法同分光光度计测酶活，反应体系缩小10倍 ，空白管加水。 蛋白质凝胶电泳 1、制备分离胶、浓缩胶 分离胶：略 浓缩胶：略 2、将酶标仪测得的编号分别为20、21、22、23的样液取10ul，点样，凝胶电泳。 染色、脱色 结果分析 蛋白质凝胶电泳图 右起1-蛋白质Marker；2-粗酶；3-23；4-22；5-21；6-20 由电泳图分析得肌酸酶的大小约为55KD，根据所查的文献得知该酶的大小为54KD。