酶切鉴定.pptVIP

　　　限制性内切酶是DNA操作过程中所使用的基本工具。其特异性地结合于一段特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。限制酶的切割点因酶而异，有些产生带平端的DNA片段，而另一些产生带有粘性末端的DNA。 在一个洁净的1.5 ml离心管中混匀下列反应物： 思考题 1、影响限制性酶切的因素有哪些？ 2、结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？ 3、如何设置酶切反应的对照？ * 质粒DNA的酶切鉴定 实验原理 限制性内切酶切割DNA Construction of pGEM-xy1 Primer of PCR: PAP 5 GACCACGCGTATCGATGTCGAC mA5 5 GGCCAGGAGATTGAACTCAAG B: A: C: Mouse cells X-gene cDNA Ligation Ampr f1 ori pGEM-T Easy Vector(3015 bp) T T LacZ Apa I Sph I Nco I Not I EcoR I Spe I EcoR I Not I Pst I Sac I Ampr f1 ori pGEM- mA1-5R (3204 bp) LacZ Spe I EcoR I Not I Pst I Sac I 189 bp Apa I Sph I Nco I Not I EcoRI T7 pGEM-xy1 mA5 PAP 189 bp Strategy of construction D: Identify positive clone The product of PCR Sample M 189 bp Sample/EcoRI M 189 bp 3015 bp 3204 bp 0.5 EcoR I 20 总计 6.5 ddH2O 1 RNase 2 10×Buffer 10 质粒DNA 体积（μl） 反应物 实验方案 注意采用混合配样 根据核酸的解离性质，用中性或偏碱性的缓冲液使核 酸解离成阴离子，置于电场中便向阳极移动，这就是 电泳。 凝胶电泳有许多优点：简单、快速、灵敏、成本低。 常用的凝胶电泳有琼脂糖(agarose)凝胶电泳和聚丙烯 酰胺(poly-acrylamide)凝胶电泳。可以在水平或垂直 的电泳槽中进行。凝胶电泳兼有分子筛和电泳双重效 果，所以分离效率很高。 核酸电泳 (一) 琼脂糖凝胶电泳 以琼脂糖为支持物。电泳的迁移率决定于以下因素： 1. 核酸分子大小 迁移率与分子量对数成反比。 2. 胶浓度: 迁移率与胶浓度成反比。 3. DNA 的构象: 一般条件下迁移率: 超螺旋DNA 线形DNA开环DNA 4. 电压: 一般不大于5V/cm。在适当的电压差时，迁移率 与电流大小成正比。 5. 碱基组成: 有一定影响，但影响不大。 6. 温度： 4~30℃都可，常在室温。 电泳时，在胶中加人荧光染料如溴化乙锭(EB)，EB 为扁平分子，很易插入DNA中的碱基对之间。DNA与 EB结合后，紫外光照射时可发射出红橙色可见荧光。 Eb可引起移码突变。 溴化乙锭 吖啶橙 放射菌素D DNA鉴定的三种荧光染料及与DNA的相互作用 （二）聚丙烯酰胺凝胶电泳 以聚丙烯酰胺作支持物。常用垂直板电泳。单体丙 烯酰胺在加入交联剂后，就成聚丙烯酰胺。由于这 种凝胶的孔径比琼脂糖凝胶的要小，所以可用于分 析分子量小于1000 bp的DNA片段。聚丙烯酰胺中一 般不含有RNase，所以可用于RNA的分析。但仍要留 心缓冲液及其他器皿中所带的RNase。 聚丙烯酰胺凝胶上的核酸样品，经啡啶溴红染色， 在紫外光照射下，发出的荧光很弱，所以浓度很低 的核酸样品不能用此法检测出 注意事项 直接在抽提的质粒DNA管中加入酶切体系。 为使微量操作更精确，可以4个人（8 tubes）一起做9 份酶切 体系混合液，然后再分装10ul于各质粒管中。 上样时要小心操作，防止样品溢出。 接触凝胶时，因其中含有EB，要戴手套，废物丢弃要 在固定位置。 5. EB是极强致癌物！小心！ *