3α―HSD单克隆抗体的制备及其鉴定.docVIP

3α―HSD单克隆抗体的制备及其鉴定 　　摘 要：为制备抗3α-HSD蛋白单克隆抗体（MAb），以已表达纯化的高纯度3α-HSD 蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠，利用杂交瘤技术，经过免疫和细胞融合后筛选出特异性的抗3α-HSD蛋白单克隆抗体，成功冻存35株IgG类型阳性杂交瘤细胞株。对14号和20号Anti- 3α-HSD进行亲和性测试，发现其与可溶性抗原蛋白的亲和常数分别为3.7E+09和4.2E+09，二者可与抗原牢固结合，具有良好的亲和性。 　　关键词：3α-HSD；单克隆抗体；制备；鉴定 　　中图分类号：R392.11 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.05.0074 　　睾丸酮丛毛单胞菌在含有类固醇的培养基上或环境中存在类固醇底物诱导时，可产生多种类固醇脱氢酶和11种降解酶，其中3α-HSD（3α-hydroxysteroid dehydrogenase， 3α-HSD）是一种能够利用分解甾体类和多环芳烃类化合物来获取菌体生长所需要的碳源和能源的关键酶。3α-HSD的中文全称是3α羟基类固醇脱氢酶，目前认为，3α-HSD不仅是睾丸酮丛毛单胞菌在以类固醇为唯一碳源时产生的一种醇脱氢酶，也是降解类固醇的关键酶，广泛地存在于原核和真核生物体内，是人体调节性激素代谢水平的重要物质[1-4]。 　　在睾丸酮丛毛单胞菌降解甾醇类化合物类固醇的过程中，随着甾体类激素等诱导剂浓度的提高，3α-HSD的翻译表达量相应提高，在一定范围内与甾体类激素含量形成了线性关系[5]。基于这种间接的线性关系，可利用3α-HSD单克隆抗体，实现对环境或食品饲料样品中睾丸酮或类固醇类激素的准确定性以及定量检测。研制3α-HSD单克隆抗体，可推动这种新型甾体激素检测方法更为广泛地用于监测环境中甾体激素污染的整体情况，以及食物、饲料中类固醇类有害成分的快速初筛。目前，国内外尚无针对睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD酶蛋白单克隆抗体制备的报道，本研究利用已表达纯化的高纯度3α-HSD 蛋白，通过免疫技术和细胞融合技术，制备其单克隆抗体，为建立甾体类激素的快速检测方法及睾丸酮丛毛单胞菌降解类固醇类物质的机理研究奠定基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 试验材料与试剂 　　IMDM培养基、IMDM完全培养基（含15%血清）、新生牛血清为实验室保存；2.2%甲基纤维素（货号：M0262-100G）、HAT（货号：H0262-10V）、HT（货号：H0137-10VL）购自SIGMA公司；PEG1500购自Roche公司（货号：78364）；标记山羊抗小鼠IgG/HRP购自中杉金桥公司（货号：72324）；二筛和三筛所用包被抗体和各型亚类二抗抗体试剂购自Southern Biotech公司。标准分子质量蛋白质购自上海丽珠东风生物技术有限公司。6～8周龄雌性BSPF级Balb/c雌性小鼠购自北京华大基因公司。 　　1.2 方 法 　　1.2.1 抗原检测 对课题组已原核表达和纯化的睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD融合蛋白进行SDS质控检测，电泳条件为丙烯酰胺12%；浓缩胶恒压80 V；分离胶恒压100 V；考马斯亮兰染色60 min；脱色30 min后观察检测结果。 　　1.2.2 免疫 选用4只BALB/c雌性小鼠， 8周龄，20 g左右。用通过质控的3α-HSD融合蛋白，每只小鼠按60 μg蛋白的量，皮下初次免疫4只SPF Balb/c雌性小鼠，编号为：1，2， 3，4。14 d后，皮下第1次加强免疫，免疫量为30 μg?只-1。28 d后，皮下第2次加强免疫，免疫量为30 μg?只-1。42 d后，皮下第3次加强免疫，免疫量为30 μg?只-1。50 d后，眼眶取血，测多抗血清效价。 　　1.2.3 效价检测 将抗原蛋白溶于2 g?mL-1醋酸盐包被缓冲液，4 ℃包被过夜；1%BSA， 37 ℃封闭2 h；多抗血清从200倍开始2倍梯度稀释，空白对照（blank）为PBS，阴性对照（negative）为阴性血清200倍稀释。用分光光度计读取OD值，选取效价最高的小鼠进行融合试验60 d。 　　1.2.4 细胞融合 将状态良好的sp2/0细胞与末次免疫后3 d所取的小鼠脾细胞进行融合， 融合方法采用PEG法。将状态良好的sp2/0细胞轻柔地从培养瓶壁上吹打下来，吸入到50 mL离心管中。小鼠摘眼球取血，然后拉颈处死，放入75%的酒精中浸泡5 min。在平皿中倒入少量无血清的IMDM，将细胞筛及注射器内芯放入平皿中。用剪刀和镊子取下小鼠的脾脏，放到细胞筛上。用注射器的内芯轻轻地将脾充分碾碎，将碾好的细胞吸入到装sp2/0的离心管中，1 500 r?min-1离心5 min。用剪刀和