培训课件--肿瘤细胞培养和杂交瘤技术.ppt

2、克隆效应（cloning efficiency） 克隆效应也可称为集落形成率（rate ov colohy formation），是检测群体细胞中增殖细胞的比率，可反应细胞系的增殖能力，因此是鉴别肿瘤细胞（或转化细胞）与正常细胞的增殖能力的指标。 材料 培养皿，生长培养基，甲醇，Gimsa染液，血球计数器。 方法 （1）对数生长的癌细胞或转化细胞及其母系细胞，每种细胞接种3个平皿，于实验前一天换液。实验当天，显微镜下观察细胞生长情况良好，用trypsin充分消化，必须制备成单个细胞悬液。计数细胞，将细胞悬液浓度稀释到每毫升250或150个细胞，每个平皿接种2ml细胞悬液（每皿300或500个细胞） （2）CO2培养箱培养2~4周。 （3）取平皿，用PBS冲洗自然干燥，用甲醇固定10分钟，Giemsa染色。立体显微镜下计数集落，每个集落需达50个细胞。 （4）计算集落形成率：集落形成率=平均集落数/每皿接种的细胞数。 结果 肿瘤细胞和转化细胞具有较高的集落形成率，通常可达10%以上，正常细胞有较低的集落形成率，仅1%左右。 注意事项 该实验是检测在群体细胞中增殖细胞的比率，试验需接种低密度细胞，3cmX3cm平皿接种300~500个细胞，消化细胞要充分，以保证制备单个细胞悬液和接种单个细胞形成的集落。由50个以上细胞组成的细胞集落计数，低于50个细胞不能计数。 3、放射自显影测定细胞饱和密度 核素放射自显影是用核素电离辐射对核子乳胶感光作用显示核素的分布、定位和定量的方法。嘌呤和嘧啶碱基是细胞DNA合成的前体，标记有放射性核素的碱基加入培养细胞液中，可以渗入到细胞DNA合成，细胞经过洗涤，固定涂乳胶，干燥后，于暗室中曝光，经显影后，细胞可在光镜下检测银颗粒，计算出标记细胞的百分数。由于癌细胞或转化细胞失去接触性抑制，无限制性生长，因此标记指数高。 材料 DMEM培养基+10%灭活胎牛血清，用DMEM培养基配制，3H-胸腺嘧啶（3H-thymidine），使浓度为1u Gi/ml，PBS ，0.25%TRYPSIN+0.04%EDTA，含盖玻片的培养皿，血球计数器，固定细胞，冷醋酸甲醇（acetic:methanol为1：3,ice-cold）新鲜制备，去离子水，放射自显影，乳胶，曝光盒。 方法 （1）培养细胞和核素标记：对数期生长的癌细胞（或转化细胞）于试验前一天换液，0.25%trypsin+0.04%EDTA 充分消化细胞，用含血清DMEM制备每毫升105个细胞悬液，接种到多个含有盖玻片的培养皿中，于CO2暖箱37℃培养。2-3天后，每日换液。当盖玻片细胞已成片汇合，每日取出玻片，用消化液消化细胞，制备细胞悬液，计数细胞。当盖玻片上计数细胞，已达到平坦期，用无血清DMEM培养基洗涤细胞表面，去除血清。加入2ml含1uci/ml的胸腺嘧啶DMEM培养基，继续培养24小时于CO2暖箱37℃。 （2）固定细胞：用PBS轻轻冲洗玻片以去除未标记的核素，将盖玻片旋转在载玻片上，细胞面朝上，细胞用冷醋酸甲醇固定10分钟。 （3）放射自显影： ①涂片乳胶：暗室红灯下46℃水浴中，熔化乳胶，将培养细胞的小玻片用胶布固定在载玻片上，浸泡乳胶，保持在46℃5秒钟，俣乳胶均匀涂细胞上，取出的玻片放在切片架上，使乳胶习题成薄片，使其慢慢干燥（2-3小时）。把干燥片放入严密的曝光盒内，于4℃冰箱曝光。曝光时间长短取决于多种因素，一般3-7天不定。 ②显影和定影：显影时间取决于核素的剂量，一般20℃左右，显影3~5分钟，经过1%醋酸溶液1-3分钟，置于定影液中30-60分钟。 ③染色和封片：用水洗2分钟，用去离子水洗1次，用Giemsa染色，将盖玻片黑覆盖在玻片上封片。 ④镜检：高倍光镜下可见细胞核银染颗粒，为标记阳性。 结果 计数标记的细胞数（核或细胞有银染颗粒 ）占总细胞数的百分率，为标记指数。癌细胞或转化细胞标记指数高于正常细胞，显示过饱和生长，转化细胞与母系相比有明显差异。 注意事项  应将检测的细胞培养到平坦期时加入核素标记细胞，以显示癌细胞或转化细胞失去正常细胞接触抑制或呈过饱和密度生长。为了很好计数细胞中的银染颗粒，应保证细胞中的银染颗粒呈较高密度。应在实验操作中避免残留核素造成的细胞背底过高，影响计数结果。 4、软琼脂集落试验 肿瘤细胞或转化细胞，由于膜表面粘蛋白的改变，丧失附着于坚实的支持物上才能生长的特点（停泊依赖），能在软琼脂上（半固体）上生长。因此可以鉴别肿瘤细胞（转化细胞）和正常细胞，是细胞恶性生长指标。制备低浓度的琼脂，将培养基细胞加入40℃水浴的琼脂中混合后，分装到平皿，2-3周后，肿瘤细胞可以生长出集落。 材料 培养的转化细胞，培养瓶，恒温水浴箱，离心机，血球计数器，琼脂糖，生长培养基，胎牛