培训课件--动物细胞工程制药.ppt

对产品的质量要求：产品纯度、产品生物活性、产品比活性，产品蛋白质性质的鉴定，产品中杂质的检测，产品的稳定性，产品临床前的安全性和有效性评价，产品临床试验的安全性和有效性评价 第九节 动物细胞制药的前景与展望 一、改进表达载体，提高表达水平和产量 采用更强的启动子和增强子 更好地利用扩增系统或寻找高表达位点 采用和改造更好的宿主细胞 二、利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本 采用代谢工程改造工程细胞 代谢工程（metabolic engineering），即采用基因工程的手段，使工程细胞增加或减少某种酶，改造它的代谢能力和途径，使其降低对某些营养物质的需要，减少某些代谢产物的产生和危害，以及控制工程细胞的增殖速度和制造产品的能力 改进培养工艺，降低生产成本 优化培养工艺 三、抑制细胞凋亡，延长培养周期 细胞凋亡：一种由遗传基因决定的程序性细胞主动死亡 防止细胞培养过程中细胞凋亡的三种措施：①通过培养基和氧的优化供应防止营养和氧的缺乏；②用化学添加剂如抗氧化剂等阻断细胞凋亡过程；③采用抗细胞凋亡基因改造工程细胞 Simpson等将TB/C3细胞稳定转染bcl-2后，细胞活力增强，抗体滴度上升 Itoh等发现转染了bcl-2的2E3细胞，其抗体生产能力比未转染细胞提高了4倍 Huang等实验表明，当共表达bag-1和bcl-2基因时，可产生相同的或协同的抗细胞凋亡作用 四、采用糖基化工程，提高产品质量 蛋白质有两种糖基化方式：N-糖基化和O-糖基化。O-糖链对蛋白质特性影响不大，N-糖链的不同对产品可产生较大的影响 决定糖链类型的主要因素：合成肽链的不同、细胞内糖基化酶的不同、细胞培养环境的影响 糖基化工程(glycosylation engineering)，即用基因工程的手段，人为地改变肽链结构、增加某些酶基因以及改进和控制某些培养条件等，以达到正确糖基化的目的 Fusseneger等报道在t-PA基因中进行点突变，改变一个氨基酸，使之增加一个糖基化位点，此时t-PA在血浆中的清除率，较原先的t-PA减少了10多倍 Minch等将t-PA与α-2,6-唾液酸转移酶基因共转染CHO细胞，表达的t-PA糖基化与人类的接近 Lamotte等将γ-干扰素基因与α-2,6-唾液酸转移酶基因共转染CHO细胞，结果γ-干扰素中α-2,6-唾液酸化程度较对照提高了68%(不加丁酸钠)和82%(加丁酸钠) 五、转基因动物的研究 1982年Palimiter等首次提出用转基因动物来生产药用蛋白。现有α1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶Ⅲ和蛋白C 等多种产品 优点：产量高、成本低、产品质量基本上与天然的一样 转基因的方法还不十分成熟，现有高效载体不多，整合位置随意性很大，因此成功率较低 转基因动物的健康问题：基因产品对动物的健康影响；产品对人体的健康影响 转基因动物的问题 六、组织工程的研究 组织工程：通过对细胞的大量培养，并用细胞直接作为一种治疗手段用于临床，或用培养的细胞进一步加工构成一种组织，如人造皮肽、人造肝脏、人造胰腺、人造血管和人造骨等，并用于临床治疗 人造皮肤已被广泛用于烧伤患者的植皮中 Brugger等在体外培养CD34细胞，输入患者的效果与非培养的细胞相同 Williams等用无血清培养基，加入人血白蛋白和细胞因子PIXY321，扩增的细胞中以粒细胞为主，用于患者后未发现毒性，而重新组成的血相与历史资料对照一样或更快 人造肝脏的研究 人造胰腺的研究（用微囊培养胰岛细胞和用膜管培养胰岛细胞） 人造血管的研究：仅美国一年血管手术就超过350,000起，需要做冠状动脉侧支循环的就有100,000例 谢 谢！ * 一、细胞分离 离心分离法：主要用于从含有细胞的体液如血液、羊水、胸腹水中分离细胞 消化分离法：先从生物体取来组织块，将其剪碎，并用消化液将其消化，使组织松散成细胞悬液，然后用缓冲液洗涤、离心、去除残留的消化液而获得所需的细胞 常用的消化物：胰蛋白酶（trypsin）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、或胰酶-柠檬酸盐、胰酶-EDTA联合使用、胶原酶（collagenase）、链霉蛋白酶（pronase）、木瓜蛋白酶（papain）等 二、细胞计数 自动细胞计数器计数 血球计数板计数 结晶紫染色细胞核计数法 MTT染色计数法 一般来说，二倍体只能传40-50代，而异倍体细胞可无限制地进行传代 悬浮细胞的传代：加入一倍或几倍的生长液，然后分种两只或多只培养瓶即可 贴壁细胞的传代：先消化再分种 三、细胞传代 四、细胞的冻存和复苏 细胞的冻存：采用液氮低温（-196℃）冻存；加保护剂如甘油和二甲基亚枫；冷冻速度以1℃/min的速度下降为宜 细胞的复苏：快融 第六