中药专业微生物学实验指导-常海林讲解.docVIP

微生物学 实验一 细菌的形态观察 【实验目的】 1.掌握生物显微镜油镜的使用方法和保护方法。 2.掌握典型细菌的形态和特殊结构。 【实验原理】 在一般微生物学实验中最常使用的是普通光学显微镜的油镜。油镜镜头透镜很小，进入镜筒的光线很少，使用时为了增加亮度，必须在标本玻片与镜头之间滴加香柏油，因为香柏油的折光率与载玻片相似，这样就可使通过集光器进入载玻片的光线不会因折射而流失，使视野明亮，物像清楚。 【实验器材】 1.显微镜、擦镜纸、香柏油、二甲苯。 2.球菌（葡萄球菌、链球菌等）、杆菌（枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞杆菌、结核分支杆菌等）、弧菌（霍乱弧菌等）标本片。 3.肺炎链球菌荚膜染色片、变形杆菌鞭毛染色片、破伤风梭菌芽胞染色片。 【方法与步骤】 1.坐姿：使用显微镜油镜时，必须端坐。镜体保持垂直位，不要使载物台倾斜，以免镜油流失影响观察。 2.识别油镜头：油镜头上一般刻有“×100”、“×90”、“Oil”等标记。 3.对光：用低倍境对光。检查染色标本时光线易强，要抬高集光器，放大光圈，取得最大亮度 4.滴加香柏油：将标本放在载物台上固定好，滴加香柏油1滴，换油镜检查。 5.调焦距：将油镜移至中央对准标本，从侧面注视镜头，并缓慢向下转动粗螺旋，使镜筒下降，直至镜头浸于香柏油中并几乎接触到标本为止。然后将视线移至目镜，一面观察一面向上慢慢转动粗螺旋，待看到模糊物像时，改用细螺旋，直至看清物像。 6.清洁保养：镜检完毕，将镜筒升起，取出标本片，用擦镜纸将镜头上的油擦干净。若油已干，可用擦镜纸蘸少许二甲苯擦去油迹，再用擦镜纸揩去二甲苯。然后，将集光器降下，各物镜呈“八”字形，放入镜箱内。 【实验结果】 绘图：油镜下观察到的荚膜、白喉杆菌、结核杆菌，并注明名称、放大倍数。 【注意事项】 1.注意观察细菌的形态、大小、排列和染色；观察细菌特殊结构（荚膜、鞭毛、芽胞）。 2.注意不要打碎标本片。 【思考题】 1.举例说明细菌的基本形态有哪些？ 2.细菌有哪些特殊结构？它们的存在有何意义？ 实验二 细菌的革兰染色法 【实验目的】 1.掌握革兰染色的方法。 2.掌握细菌的基本形态和结构。 3.了解革兰染色的原理。 【实验原理】 1.G+ 菌细胞壁结构致密(肽聚糖层厚)，且脂质含量少，乙醇不易渗入脱色。G-菌细胞壁结构致密(肽聚糖层薄)，且脂质含量多，乙醇溶解脂质后易渗入细胞而脱色。 2.G+ 菌菌体含有大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色。G-菌菌体核糖核酸镁盐含量小，易被乙醇脱色。 3.G+ 菌等电点比G- 菌低，在同一pH值条件下阳性菌比阴性菌所带负电荷要多，带正电荷的碱性染料(结晶紫)结合牢固，不易被乙醇脱色。 【实验器材】 1.显微镜、酒精灯、火柴、接种环、载玻片、吸水纸、擦镜纸、香柏油、二甲苯、生理盐水、蒸馏水。 2.草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏（Lugol）碘液、95%乙醇、复红染液。 3.金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌(培养18~24小时后待用)。 【方法与步骤】 1.标本片制备 （1）取载玻片1块，用记号笔划分为2个区域，并分别做好标记。 （2）两区各加1滴生理盐水。接种环按无菌操作法自两个斜面菌种管挑取少许菌液，分别于各区盐水中混匀涂成一薄层，接种环在火焰上灼烧灭菌。 （3）在室温下自然干燥。 （4）用片夹夹住玻片通过火焰3次固定标本，自然冷却。 2.染色 （1）初染：在固定好并已冷却的涂片标本上滴加结晶紫染液，要盖满涂膜。约1分钟后，用细水流从玻片的一端把游离的染液洗去。 （2）媒染：滴加卢戈碘液数滴，作用1分钟后，轻轻水洗。 （3）脱色：在玻片上加95%乙醇2~3滴，并轻轻转动玻片数秒钟，使玻片倾斜让乙醇流去，如此重复数次，直至流下的乙醇几乎无色或稍成淡紫色，流水冲洗。 （4）复染：滴加稀释复红染液数滴，作用1分钟后流水冲洗。 3.结果判定 （1）染色完毕，用吸水纸将标本片吸干，玻片上滴加香柏油，油镜观察。注意观察菌体的形态、大小、排列和染色。 （2）金黄色葡萄球菌染成紫色为G+ 菌，大肠杆菌染成红色为G- 菌。 【实验结果】 绘图：油镜下观察到的金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的形态，结构。 表2.1 革兰染色结果记录 菌名 菌体颜色 菌体形态 G+ 或G- ? ? ? ? ? ? ? ? 【注意事项】 1.决定革兰染色成败的关键是脱色程度。 若脱色过度，即使是G+ 菌，其蓝紫色也会被脱去而染上红色，被误认为是G- 菌（假阴性）。若脱色不足，即使G- 菌也因蓝紫色被保留而染不上红色，被误认为G+ 菌(假阳性)。脱色程度又受脱色时间、涂片之厚薄、脱色时载玻片摇晃的快慢及酒精用量多少等因素的影响，无法严格规定。一般可用已知G+ 菌和G- 菌作练习，以掌握脱色时间。当要确证一个未