微生物遗传与分子生物学讲解.doc

微生物遗传与分子生物学 （5*15+1*25 100分） 本课程主要涉及到微生物中主要的模式菌株: 原核微生物: 放线菌 链霉菌 ,大肠杆菌,芽孢杆菌,乳酸菌，古菌等。 真核微生物：汉逊酵母，酿酒酵母，白念珠菌等。 概论 基因的符号： 每个基因：如色氨酸基因trp； 同一表型的不同基因：如trpA或trpB等。 当染色体上发生缺失时可用Δ表示（如ΔtrpA或ΔtrpA）； 基因突变：如亮氨酸缺陷型leu-； 抗药性基因：r表示抗性，加s表示敏感 如链霉素抗性基因表示为strr，敏感基因表示为strs。 微生物基因突变一般分几种类型,突变有什么生物学意义?（谭老师） 基因突变可从突变发生方式和突变引起的表型改变和遗传物质改变等方面进行分类。按突变体表型特征的不同，可把突变分为以下4个类型: 1 . 形态突变型2 . 生化突变型3 . 致死突变型: 按突变所引起的遗传信息的改变，又可把突变分为： 1 . 错义突变 2 . 同义突变3 . 无义突变 根据遗传物质的结构改变，可分为碱基置换、移码、DNA片段插入和缺失。 根据突变发生的方式，可分为自发突变和诱发突变。 突变的生物学意义： 基因突变导致了基因表达出来的性状发生了改变，对突变个体本身来讲，绝大多数是有害的，因为现有的生物基本上都适应了现在的环境。 但是环境是可变的，如果生物不变，那就很可能被淘汰。所以，对整个生物群体来说，突变使群体不会灭亡。环境不断改变，生物通过不断突变而适应, 也就使其被保存下来。 最终，物种的面貌特征与祖先不同，所以说，突变是生物进化的内因，是进化的主要动力。 无数事实说明了一个真理，即宇宙间的所有物种变是绝对的，不变则是相对的。 应用于链霉菌基因组编辑与大片段DNA克隆的技术都有哪些？能否用在你们今后的实验中？（刘钢老师） 基因组编辑是指在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到改造基因组的目的。 链霉菌基因组编辑有： I-SecI endonuclease介导的同源重组系统： 敲除质粒上含有一串联的与靶片段左右臂同源的两个DNA片段以及I-SecI识别的18个碱基的位点（sceS）。将该质粒导入链霉菌细胞，并通过抗性筛选质粒插入到基因组上的克隆。如果发生同源单交换，该质粒将被完整导入基因组靶位点。通过诱导表达SecI，SecI在18个碱基的位点（sceS）切断基因组DNA，菌体不能够存活。如果发生同源双交换， sceS被删除，即使诱导表达SecI也不会造成基因组DNA的断裂，菌体仍然存活，并表现出抗性敏感。 CRISPR-Cas9介导的同源重组系统： 首先优化cas9的密码子，将其放置在强启动子之后并克隆到敲除质粒上，敲除质粒上含有sgRNA并置于组成型启动子之后， sgRNA中的引导序列为靶位点的同源序列，敲除质粒必须包括靶基因两侧的同源臂。将该质粒导入链霉菌，CRISPR/Cas9系统将靶位点切断，同时质粒上的同源臂与基因组上的同源臂发生双交换，将断裂的靶基因区删除，基因组重新连接。 （CRISPR/Cas9系统先切断靶序列后直接发生双交换，最后断裂的靶基因直接被敲除） 位点特异性整合酶介导的基因组编辑：（cre/lox系统） 利用两次同源单交换分别将两个loxP位点整合到目的基因片段的上下游，再将Cre蛋白表达质粒导入链霉菌，在Cre蛋白的作用下，两个loxP位点发生位点特异性重组，完成目的基因片段的敲除。而环化的DNA由于不能在链霉菌中复制，随着传代而丢失。 大片段DNA克隆的技术： 依赖于酵母菌的转化介导的大片段DNA重组克隆（TAR） 基于FBT1 attp-attB-int整合系统的链霉菌基因组DNA大片段克隆技术： 通过结合转移将质粒pSV::attB6Up导入链霉菌，卡那霉素筛选获得pSV::attB6Up同源整合到目的位置的菌株S-attB6。再将pKC1139::attP6Dn导入S-attB6，在40度培养， pKC1139::attP6Dn通过同源单交换整合到目的位置获得S-attB6P6。通过结合转移将含有FBT1整合酶的pIJ10500导入S-attB6P6中，利用整合酶将目的基因簇环出，并克隆到载体pKC1139上。 在今后的实验中可能会用到： 我们实验室是分子生物学实验室，这些技术方法对于我今后的研究室有助益的。我们平时多采用基本的遗传操作，构建敲除质粒载体，然后导入受体菌株进行同源重组进行单交换，利用抗生素进行筛选，随后还需要进行双交换。我们可以考虑使用基因编辑技术来进行遗传操做。比如应用CRISPR-Cas9介导的同源重组基因编辑技术来使之直接发生双交换而直接敲除靶标基因，