DNA与基因芯片幻灯片.pptVIP

第 二 十 一 章 基因诊断与基因治疗 Genetic Diagnosis and Gene Therapy 第 一 节 基 因 诊 断Genetic Diagnosis 二、基因诊断常用技术方法 二、基因诊断常用技术方法 限制性内切酶谱分析法 DNA限制性长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RLFP)间接分析 核酸分子杂交技术原理： 核酸分子杂交的流程示意图 2. DNA限制性长度多态性分析 DNA多态性：中性突变导致个体间核苷酸序列的差异 限制性长度多态性分析： 突变发生在酶切位点上，酶切DNA片段不同长度 RFLP：孟德尔方式遗传，家族中，与某一疾病紧密连锁，作为遗传标志，判定家族成员是否携带致病基因 应用：甲型血友病、囊性纤维病变、苯丙酮尿症 （二）聚合酶链反应（polymerase chain reaction PCR） （二）聚合酶链反应 组织中总RNA的提取 ↓ 利用反转录酶合成cDNA ↓ PCR反应： 反应缓冲液 模板（上述合成的cDNA） 底物（dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 引物（爱滋病病毒特异性引物） TaqDNA聚合酶 50μl 循环：95℃，30sec（变性） ↓ 55℃，1min（退火）30循环 ↓ 72℃，1min（延伸） （三）基因测序技术 末端合成终止法 (sanger法)原理 2‘,3’-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）与普通dNTP不同 之处在于其脱氧核糖的3‘位置少一个羟基，可在DNA聚 合酶作用下通过其5三磷酸基团掺入到正在增长的DNA 链中，但ddNTP因缺乏3‘羟基而不能同后续的dNTP形成 磷酸二酯键，因此，当正在增长的DNA链末端碱基为 ddNTP时，则链延伸反应终止，不可能继续延伸。这样， 在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一 种ddNTP后，链延伸将与偶然发生却十分特异的链终止 展开竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决 于从用以起始DNA合成引物末端到出现过早链终止的位 置之间的距离，结果将产生4类寡核苷酸，它们分别终止 于模板链的每一个A、C、G或T的位置上。 双脱氧链终止法的测序基础是以双脱氧核 苷三磷酸为循环测序反应的链终止剂。 （四）基因芯片技术 （四）基因芯片技术 三、基因诊断的应用 遗传疾病 肿瘤 感染性疾病，传染性流行病 判断个体疾病易感性 器官移植组织配型 法医学中个体识别、亲子鉴定 小结 基因诊断的定义 基因诊断的特点 基因诊断的常用技术 第 二 节  基 因 治 疗Gene Therapy 3.分子杂交 1) hybridize Apply sample 2) rinse 4. 检测分析 Laser 1 Laser 2 Detector 1 Detector 2 Scanner 芯片的扫描 5.图 像 处 理 Detector 1 Detector 2 False-color differential image 图 像 分 析 基因诊断方法 经典基因诊断 .限制性内切酶法 .RFLP分析法 .寡核苷酸分析法 优点 缺点 .特异基因诊断 .未知基因诊断 .直接，过程简单 .过程繁杂 .准确性低，过程繁 .条件严格 基因诊断进展 .PCR方法 .PCR-序列分析法 .DNA芯片技术 .简单、经济、敏感 .操作直接、准确 .集成度高、快速、并行 .假阳性高 .价格高 .尚无成熟产品问世 * 目 录 * 目 录 南方医科大学基因工程研究所 郭秋野 基因变异致病类型 内源基因的变异： 基因结构突变 基因表达异常 外源基因的入侵： 基因诊断和基因治疗 遗传性疾病 肿瘤、心脑血管病等 （生殖细胞） （体细胞） 病毒感染性疾病：HIV、SARS、HCV、HPV 特点： 针对性强：病因学检测 特异性强：分子杂交技术 灵敏度高：PCR、分子杂交放大效应，样品量少 适应性强：内源、外源基因 早期快速诊断： 一、基因诊断的概念和特点 定义： 利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。 （一）核酸分子杂交技术 （二）聚合酶链反应 (PCR) （三）基因测序 （四）基因芯片 （一）核酸分子杂交技术 待测核酸制备 滤膜上核酸固化 杂 交 去除未参与杂交的探针 检 测 杂 交 信 号 制备探针核酸片段 探 针 标 记 加入标记核酸探针 × MstⅡ酶切位点(GCTNAGG) 5′ 3′ 正常基因 5′ 3′ 突变