海洋放线菌BH3A8代谢产物杀线虫活性研究.docVIP

海洋放线菌BH3A8代谢产物杀线虫活性研究 摘 要：植物寄生线虫的危害日趋严重，利用生物防治技术是控制线虫危害的研究重点。对从渤海海域不同深度水样中筛选出的具有杀线活性的菌株BH3A8代谢产物进行研究，测定了BH3A8代谢产物杀线虫谱和对南方根结线虫的温室防效以及对松材线虫形态与运动频率的影响。结果表明，BH3A8代谢产物对南方根结线虫幼虫毒力最强，对松材线虫幼虫毒力次之，对大豆孢囊线虫幼虫毒力最弱。在温室测定中活性菌株发酵液对南方根结线虫防治效果为73.75%。活性菌株代谢产物明显抑制松材线虫运动频率。中毒线虫起初表现为虫体扭曲、颤抖、痉挛，接着线虫游动缓慢、扭动身躯，最后线虫反应迟钝，摆动减慢，首尾同侧展开，标志着线虫死亡。虫体死亡多为僵直状态。BH3A8杀线虫谱广、效果好、使用成本低，在生产上具有很好的应用前景。 关键词：海洋放线菌；活性菌株；杀线虫活性代谢物；毒力；防效 中图分类号：S476 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.11.003 线虫在自然界分布广泛，种类繁多，危害多种动物和植物。植物寄生线虫是植物侵染性病症主要病原之一，广泛寄生在各种植物的根、茎、叶、花、芽和种子上，一种植物可以有一种或者多种寄生线虫，使植物发生各种病变，严重阻碍了农林业的发展[1]。植物寄生线虫的种类已达100多属2 000多种[2-3]，农林业生产上的主要线虫约1 100种[4]。植物寄生线虫对农业生产的危害很大，其中危害主要农作物的寄生线虫约500多种，其危害程度超过了细菌和病毒，仅次于真菌病害[5-7]。严重危害我国农业、林业、经济作物的植物寄生线虫已达100多种，有些植物寄生线虫对作物的直接危害甚至比其他病、虫、草害都严重，一般只要作物上发生植物寄生线虫引起的病变，就可以使该作物减产10%～40%，在严重的情况下，可以减产70%～80%，最为严重的就是造成绝收[8-9]。 植物寄生线虫的非生物防治方法主要包括农业技术设施防治、抗性育种、物理防治和化学防治等4类。植物寄生线虫目前还是主要采取化学杀线虫剂进行线虫防治[10]，化学防治虽然效果好，但是其中大部分药剂对人畜有剧毒、用量高、花费大、严重污染环境和地下水源，破坏生态平衡，而且农药的残留污染直接影响农产品深加工的质量和品质，与此同时，化学农药在杀灭植物病原线虫的同时，也杀伤了天敌及其他有益生物，影响了生物多样性，破坏了生态平衡，化学杀线剂的应用正逐步受到限制[11-13]。所以生物防治成为研究热点。 在线虫的生物防治中，抗生素的应用是较为有效的防治途径之一。海洋占地表面积的71%，海洋中生态环境较陆地复杂多变，所以海洋放线菌会通过一些特殊的代谢途径来维持其生命活动。近十几年来，已经从海洋微生物及其代谢产物中发现了许多结构新颖、活性独特的活性物质，具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、杀虫等活性。目前有很多利用海洋真菌代谢产物杀线的报道，但是杀线种类较单一[14]。海洋放线菌主要分布在海底沉积物、海洋生物表面以及海水中，天津地处渤海湾，拥有丰富的海洋资源，因此，从中筛选到有杀线活性的菌株是有很大几率的[15-17]。 海洋放线菌BH3A8是本课题组从渤海不同深度海水样品中筛选出的具有杀线活性的生防菌株。本试验着重对其杀线虫谱、温室防效以及对松材线虫形态与运动频率的影响的初步机理进行研究。 1 材料和方法 1.1 材 料 供试菌株海洋放线菌BH3A8菌株是天津市农业资源与环境研究所微生物研究室筛选保藏的菌种。 1.2 试验方法 1.2.1 活性菌株BH3A8发酵液的制备 第1步，海洋放线菌菌株BH3A8的种子培养。挑取纯化菌株至种子培养液中，28 ℃，200 r?min-1，震荡培养3 d。第2步，海洋放线菌菌株BH3A8的发酵培养。配制发酵培养基，将种子液按1∶10比例转接至发酵培养液中，28 ℃，200 r?min-1，震荡培养7 d。将发酵液用甲醇萃取后旋转蒸发浓缩成8倍液后，放入-10 ℃冰箱保存。 1.2.2 供试线虫的制备 （1）松材线虫二龄幼虫（J2）的制备。参照文献[18]中松材线虫J2制备方法。在无菌操作条件下，将灰葡萄孢霉（Batrytiscinerea）接种于察氏培养基上，21 ℃下避光培养7 d，待菌丝长满培养皿后，将松材线虫接种于该菌丝上进行培养繁殖，26 ℃下避光培养5～7 d。通过贝尔曼（Baermann）漏斗法收集松材线虫，无菌水离心洗涤3次，2 000 r?min-1离心3次，每次3 min。用无菌水将离心得到的松材线虫稀释为1 000头?mL-1的悬液备用。 （2）南方根结线虫二龄幼虫（J2）的制备。参照文献[18]中根结线虫J2制备方法。取温室里接种南方根结线虫60 d后的番茄的根，将根剪成1～2 c