液相色谱梯度分析法简单介绍.docVIP

液相色谱梯度分析法简单介绍原理k， tR- t0 / t0c、温度的不同而变化。在固定相温度不变的情况下有以下关系式： ln k· -Zlnc + b Z和b为常数 由此可见，随流动相浓度c增加，容量因子k·减小。Z是每种物质的特征参数，小分子Z一般为3-5，大分子Z一般为10-100。对于小分子的样品，我们可以通过采用合适浓度的流动相来使每种物质得到分离，即平常所用的等度液相色谱分析。若对于一个既有小分子，又有大分子的样品（如含聚合物），由于Z相差较大，在相同的流动相浓度下，容量因子k·差距就非常大，简单的讲，在等度情况下，有时小分子的保留时间在4-5min，大分子保留时间可能在100min以上，更有甚者在有限的时间内不出峰。 梯度分析法就是为解决这个问题产生的。它是采用特殊的设备使流动相的浓度随时间变化，对保留弱的用浓度小的流动相，对保留强的用浓度大的流动相，使各组分较为均匀的流出。例如对于某样品用60％流动相、80％流动相和梯度（30min内从60％-100％）的分离效果如下。 从上可以看出用60％流动相分离效果好，但用时150min，用80％流动相分离效果已经很差了，用时仍达80min，而用梯度的方法分离效果很好，用时只有50min，另外，保留时间长的色谱峰没有明显变宽。 设置方法 另一种是高压梯度，它是靠两个或更多的输液泵不同流速来直接实现各流动相的比例，例如需控制A:B 40:60，总流速为1mL/ min时，直接设A泵流速0.4mL/ min，B泵流速0.6mL/ min。实际上我们只需设B液的比例和总流速，仪器会自动设置A泵流速。 从以上我们可以看出低压梯度设备便宜，但流动相比例精度不够，而且存在浓度梯度延迟。高压梯度设备较贵，精度好，浓度梯度延迟很小。目前我们所用的就是高压梯度，它由两个泵组成，用光纤连在一起，一个主泵一个付泵，由主泵控制付泵，G.E.灯亮的是主泵。设置方法：按FUNC键一直到显示SYS，主泵设为2，付泵设为1。 梯度设置方法：我们只需设置一个时间段两端时间点和该时间点的浓度，仪器自动控制浓度在该时间段内线性变化。对每个时间点有三个参数：时间点（Time）、功能 FUNC 、数值 VALUE 。例如对以下梯度（浓度变化图如下）设置方法为： 0.01min 20%B 5min 20%B 10min 30%B 15min 60%B 20min 60%B 30min 100%B 35min 100%B 35.01min STOP 按EDIT键，出现USED 0 , LEFT 297, 若UESD不为0，按ENTER键两下，按DEL键直至出现USED 0 。按ENTER键，输入0.01，ENTER, FUNC两次，出现BCONC, 输入20，ENTER；输入5，ENTER, FUNC两次，出现BCONC, 输入20，ENTER；输入10，ENTER, FUNC两次，出现BCONC, 输入30，ENTER；输入15，ENTER, FUNC两次，出现BCONC, 输入60，ENTER；输入20，ENTER, FUNC两次，出现BCONC, 输入60，ENTER；输入30，ENTER, FUNC两次，出现BCONC, 输入100，ENTER；输入35，ENTER, FUNC两次，出现BCONC, 输入100，ENTER；输入35.01，ENTER, FUNC出现STOP , ENTER；按CE回主界面。 注意事项及常见故障排除