次级淋巴组织趋因子的基因克.docVIP

目 录 中文摘要 3 英文摘要 6 第一部分： 人次级淋巴组织趋化因子（SLC）的基因克隆及在大肠杆菌内表达 第一部分 成熟人SLC基因克隆及序列分析 前言 10 材料 10 方法 11 结果与讨论 16 小结18 附图19 第二部分 人SLC在大肠杆菌中的表达及重组蛋白的鉴定 前言 23 材料 23 方法 24 结果 28 讨论 29 小结 29 附图30 第三部分 小鼠次级淋巴组织趋化因子(SLC)基因的克隆、瞬时 表达及抗肿瘤作用初步研究 前言 35 材料 35 方法 36 结果37 讨论 40 小结 41 附图42 论文总结 参考文献 发表论文与综述 致谢  次级淋巴组织趋化因子的基因克隆表达 及抗肿瘤作用研究 专 业 免疫学 研究生 董忠军 导 师 赵跃然 中 文 摘 要 一 立题依据和目的 次级淋巴组织趋化因子SLC (Secondary Lymphoid tissue Chemokine ) 又称6CKine 、Exodus2 和TCA(Thymus-derived Chemokine Agent4)，是由 Nagira 等1997年用信号序列捕获(signal sequence trap)法寻找趋化因子同源 序列时在人EST 文库里克隆出的新的CC趋化因子。几年研究表明SLC对多种免 疫细胞特别是对T细胞具有趋化作用，其趋化的归宿主要为次级淋巴组织或器 官，因而SLC被认为是第一个参与体内淋巴细胞归巢( Lymphocyte homing )的趋 化因子。无论是重组SLC蛋白瘤内注射还是基因转染肿瘤细胞或树突状细胞，SLC 均有显著的抗肿瘤作用，所以是一种较有发展潜力的抗肿瘤药物。目前，国内外 实验研究用SLC均来自杆状病毒表达产品，我国已有在大肠杆菌融合表达SLC的 报道，由于目前还没有杆状病毒表达产品上市供人使用，且融合蛋白也不可用于 人体等原因，我们试图通过高效表达载体pBV220实现SLC在大肠杆菌内非融合表 达，用于SLC的生物学作用的研究。 肿瘤免疫治疗的方法主要是利用免疫刺激细胞因子、协同分子和一些免疫细 胞，但是，这些方法均表现局限的抗肿瘤反应，特异性的抗肿瘤反应需要吸引大 量的效应细胞到抗原呈递部位，趋化因子在这种免疫反应中发挥重要作用。 Sharma,-S等首次使用重组SLC注射到3LL肺癌细胞系荷瘤小鼠瘤内，40%肿瘤完 全消退，且在肿瘤局部和全身检测到系统性和局部免疫反应，包括CD4T细胞、 CD8T细胞和树突状细胞明显上升，并伴有Th1类细胞因子上调，而免疫抑制细胞  因子IL-10显著下降，体外检测肿瘤局部浸润的淋巴细胞细胞毒活性明显增强， SCID小鼠以及CD4、CD8基因敲除小鼠没有观察到SLC抗肿瘤活性，表明T细胞 在SLC抗肿瘤效应中发挥主导作用，到目前还没有证实NK是否参与SLC抗肿瘤的 报道，不过有人已经证实NK参与ELC的抗肿瘤作用，基于ELC和SLC的诸多相同 点，且NK也表达SLC受体(CCR7),推测NK很可能参与抗肿瘤效应。 二 方法和结果 1. 人SLC成熟肽的基因克隆及在大肠杆菌中的重组表达 取正常人淋巴结，用本室制备的RNA提取试剂盒分离纯化细胞总RNA。以RNA 模板，随机六聚体核苷酸为引物，在M-MLV逆转录酶的作用下进行反应，合成 cDNA的第一链。根据GeneBank报道的SLC的编码序列，设计扩增成熟SLC基因 的上、下游引物，分别在5，端加上限制性酶切位点 EcoRI和BamHI。设计上游引 物时，在成熟SLC编码序列的上游加上起始密码子ATG,同时在上游加上保护性碱 基TA,下游加上AA，降低G+C含量，防止二级结构的形成，提高重组蛋白质的表 达含量。以RT反应物为模板，用Taq DNA聚合酶进行PCR，扩增SLC基因。用低 熔点琼脂糖凝胶电泳分离纯化PCR扩增产物后，与pMD18-T载体连接，转化大肠 杆菌，接种含100ug/ml氨苄青霉素的LB平板。用菌落PCR和限制性酶谱分析筛 选出阳性克隆，采用ABI100 全自动DNA测序仪测序，结果显示，克隆的基因和 预期的成熟人SLC基因完全一致，成功构建了SLC重组质粒pMD18-hSLC。 用EcoRI和BamHI双酶切消化重组质粒pMD18-hSLC，低熔点琼脂糖凝胶电泳 分离纯化SLC片断，插入原核表达载体pBV220的PL启动子的下游，构建重组 SLC表达载体。重组子同样用菌落PCR和限制性酶谱分析筛选出阳性克隆，从而 获得重组阳性质粒pBV220-hSLC。含有pBV220-SLC的大肠杆菌（工程菌株）接