分子生物学(1个主干实验)步骤.docVIP

《生物学实验四》实验操作步骤 2010年3月 实验一、细菌培养、细胞培养 实验二、昆虫病毒DNA的分离、纯化和鉴定 　1、2 ml病毒感染的培养细胞悬浊液 ↓8000 r/min 4℃ 10min，去上清 2、 加PBS漂洗混匀 ↓ 8000 r/min 4℃ 10min ，去上清 3、加250μl TE 悬浊 ↓ 4、加250μl Lysis　Buffer裂解细胞 ↓ 5、 加20μl Proteinase K（10mg/ml ） ↓50℃ 4h /37 ℃ 过夜 6、加3μl RNase A（10mg/ml ） ↓37℃ 30 min 7、 加等体积酚-氯仿 ↓12000 r/min 4℃/10min 取水相（剪枪头，烤平） 8、重复步骤7 9、水相加1/10体积 3mol/L NaAC（pH4.8） ↓ 10、加2倍体积的无水乙醇沉淀病毒DNA ↓-20℃，过夜 ↓12000 r/min 4℃/5min，去上清 11、70% 乙醇洗涤沉淀 ↓12000 r/min 4℃/5min 去上清 12、重复步骤11 13、适量TE 溶解 ↓ 14、电泳鉴定 实验三、PCR扩增昆虫杆状病毒基因及其产物的鉴定PCR反应体系 TaqDNA 聚合酶 0.5μl 10×PCR Buffer 5μl dNTP 4μl Template 病毒基因组DNA 1μl Primer1 1μl Primer2 1μl ddH2O 37.5μl —————————————————— Total 50 μl 2、PCR反应程序： 94 ℃ 3min 94 ℃ 30s 55 ℃ 30s 3 cycles 72 ℃ 1min 72 ℃ 10min 4 ℃ forever 实验四、质粒DNA的分离、纯化和鉴定LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜 ↓ 2.取1.5ml培养物倒入Eppendorf管中，4℃ 3000r/min 离心5min ↓ 3.吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥 ↓ 4.碱法少量快速抽提质粒DNA（详见4） ↓ 5. 质粒DNA的鉴定DNA 单菌落 Sup ↓接种 ↓ 3ml LB培养基（含Amp或Kan 100ug/ml） add 等体积酚：氯仿（1：1） ↓ ↓混匀 37℃ 200rpm振荡过夜培养 4℃、 12000rpm、 10min ↓ ↓ Sup ↓ 取1.5ml培养物于Eppendorf管内 add 2×Vol无水EtOH ↓ ↓混匀 4℃、3000rpm、5min -20℃ 30min 以上 ↓ ↓ PPT 12000rpm、 10min ↓ ↓ add 100ul SolⅠ PPT ↓mix on ice 10min ↓ add 200ul SolⅡ add 70% EtOH ↓轻轻颠倒数次，混匀，on ice 10min ↓混匀 add 150ul SolⅢ 8000rpm、 5min ↓快摇数次，on ice 10min ↓ 4℃、12000rpm、10min PPT ↓ ↓ Sup 晾干或真空抽干 ↓ ↓ add 等体积酚 20-40ul TE ↓ ↓ 4℃、12000rpm、10min -20℃ 保存 ↓ 5. 琼脂糖凝胶电泳 1 ?制备琼脂糖凝胶 按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表： 琼脂糖凝胶浓度/% 线性DNA的有效分离范围/kb 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-4 2.0 0.1-3 称取0.2g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入20ml 1×TAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液，冷到60℃左右时按100ml的凝胶加5μl的goldview。 2 胶板的制备 ▲? 取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙）。 ▲ 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。 ▲ 将冷到60℃左右时的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。 ▲? 待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在电泳槽内。 ▲? 加入电泳缓冲液至电泳槽中。 3 加样 用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔中（记录点样顺序及点样量）。 4 ??电泳鉴定 ▲接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。 ▲当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。? 实验五、大肠杆菌感受态细胞的制备1.从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落接于3ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。