培养基的保存温度对牛卵母细胞体外受精的影响.docVIP

培养基的保存温度对牛卵母细胞体外受精的影响 　　摘要：研究了培养基保存温度对牛卵母细胞体外受精的影响。结果表明，基础培养基中激素不同添加时间对牛卵母细胞体外成熟率、牛体外受精胚胎卵裂率及囊胚率差异不显著（P0.05）；提前添加激素在4 ℃不能长期保存，而在-20 ℃能长期冷冻保存，并不会对牛卵母细胞体外受精胚胎的发育产生太大的影响。 　　关键词：培养基，保存温度；牛；卵母细胞；体外受精 　　中图分类号：S823 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）01-0137-03 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.01.036 　　牛体外受精技术（In vitrofertilization，IVF）一直是研究的热点。近年来，随着养牛业的发展，牛体外受精技术已日趋成熟。但由于体外受精技术操作环节复杂，操作过程涉及因素较多，以及卵母细胞、受精卵和早期胚胎对体外生存环境要求较高，使得试验体系不稳定，可重复性差，进而影响试验结果的准确性[1]。 　　目前牛胚胎的体外生产技术已得到很大提高，但是还存在着生产效率较低、培养体系不稳定等问题。笔者主要从培养基的不同保存温度方面探讨了培养基的保存条件对黄牛卵母细胞体外成熟及其体外受精的影响，旨在进一步寻求更为理想的培养基保存条件，从而为进一步提高动物胚胎体外生产的效率提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　试验用的卵巢来自于武汉市牛屠宰点；冷冻精子来自于武汉市奶牛改良站。 　　1.2 试剂 　　成熟培养液（mTCM-199）：基础培养基TCM-199（Gibco）+10% FBS+10 IU/mL人绒毛膜促性腺激素（HMG）+雌二醇（E2）+100 IU/mL双抗。体外受精液：BO液，体外受精获能液：BO液+5 mmol/L咖啡因+10 mg/mL肝素钠+3 mg/mLBSA[2]。受精卵培养液：CRLaa。 　　1.3 试验方法 　　1.3.1 卵母细胞采集及培养 母牛被屠宰剖腹后，立即无菌摘取卵巢，放入添加双抗的25～35 ℃灭菌生理盐水中4 h内送回实验室。卵巢组织用灭菌且预热的生理盐水清洗3次，用10 mL无菌注射器（内有少量平衡后的DPBS）抽取卵巢表面直径为2～8 mm的卵泡，抽取液注入15mL尖底离心管中，置于30 ℃的水浴锅中。待COCS沉淀后，弃上清。将检出的COCS用含体积分数为5%胎牛血清（FBS）的DPBS和成熟培养液各洗涤3次，移入含有成熟培养液滴的直径为35 mm培养皿中。每个液滴100 μL并覆盖石蜡油，每滴放COCs10～15枚。液滴预先在二氧化碳培养箱中平衡2 h以上。成熟培养条件39 ℃，5% CO2，相对饱和湿度。 　　1.3.2 体外受精 　　1）精子的处理。从液氮罐取细管冻精2支放入37 ℃水浴中30～40 s快速解冻，用75%乙醇消毒后剪开细管，将精子放入含有1 mL BO液的离心管中，二氧化碳培养箱中倾斜静置1 h，使精子上浮，上浮后将上浮的精子用BO液1 500 r/min，5 min离心洗涤2次。 　　2）精子获能处理。将离心洗涤的精子进行获能15 min。 　　3）卵子的体外受精。将体外成熟培养22～24 h的卵母细胞，用0.25%的胰酶进行消化处理后，捡取有第一极体的卵母细胞进行受精。成熟卵子放入3×105个/mL获能精子浓度的体外受精悬浮液滴，在与成熟培养液条件相同的条件下培养5 h，然后用受精卵培养液CRlaa（10～15枚/50 μL）进行体外培养[3]。 　　1.4 受精卵的体外培养 　　受精后的牛卵母细胞用已平衡好的受精卵培养液洗涤3～5次后，转入50 μL受精卵体外培养微滴中，每滴10～15枚，在39℃、5% CO2、相对饱和湿度条件下培养48 h。受精后48 h观察统计受精率和卵裂率。每隔24 h半量更换培养液，观察受精卵发育情况。 　　1.5 试验设计 　　①基础培养基中激素不同添加时间（平衡时添加、提前添加后放4 ℃冰箱保存）对牛卵母细胞体外受精的影响；②成熟培养基mTCM-199不同保存温度（4 ℃、-20 ℃）对牛卵母细胞体外受精的影响。 　　2 结果与分析 　　2.1 基础培养基中激素添加时间对牛卵母细胞体外受精的影响 　　基础培养基中激素添加时间对牛卵母细胞体外受精的影响见表1，结果表明，两种添加方法（即在平衡培养基时添加激素与平衡前添加激素后放冰箱）对成熟率、卵裂率及囊胚率差异不显著（P?0.05）。 　　2.2 成熟培养基mTCM-199在4 ℃时保存时间对牛卵母细胞体外受精的影响 　　由表2可知，成熟培养基mTCM-199在4 ℃时保存1周和2周对卵母细胞体外成熟率、卵裂率