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毛白杨抗锈病基因筛选与NBS型抗病基因分析 （作者：张谦，导师：张志毅教授） 摘要 毛白杨（Populus tomentosa Carr.）是我国特有的白杨派乡土树种，具有分布广、速生、抗逆性强、材质优良等特性，是重要的工业用材林、农田防护林树种，同时是北京等北方城市园林绿化美化的重要树种。然而，毛白杨在生长发育过程中常常受到病原物的危害，尤其是毛白杨锈病，使其生长与生产受到严重影响，已引起人们广泛关注。目前有关毛白杨抗病研究十分薄弱，在抗病遗传资源筛选、抗病品种选育、抗病基因定位与克隆等方面仍属空白，这远远落后于黑杨派与青杨派树种的抗病研究，也与毛白杨生产中迫切期待解决病害的需求形成了鲜明的反差。为此，本研究通过毛白杨锈病活体接种试验，筛选到具有强抗病能力的无性系；运用PCR方法，从中克隆到NBS型抗病基因同源序列，对这些基因的进化关系与表达模式进行分析，并从中筛选到1个毛白杨锈病抗性相关基因（DQ324288）；通过RACE-PCR分析，克隆到DQ324288基因家族的2个成员，并对其组织表达特性与诱导表达规律进行研究。在构建抗病基因原核表达载体、RNAi干扰载体和正义表达载体基础上，开展原核表达以及烟草和杨树的遗传转化研究，获得一批转基因植株，并对转基因烟草进行抗病试验。此外，以毛白杨RGA为探针，运用生物信息学方法从毛果杨基因组中克隆到74个NBS型抗病基因，研究这些基因的结构特点和进化关系，并对这些毛果杨基因在三倍体毛白杨各组织器官中的表达特性以及在多种生物和非生物诱导胁迫下的表达规律进行分析。通过上述研究可得到以下主要结果： 1、本研究以先前筛选得到的抗逆性强的28个毛白杨杂种无性系为试材，以致病性强的马格栅锈菌（Melampsora magnusiana Wanger）为病原物，进行毛白杨锈病活体接种试验，结果发现，在供试材料中，有13个具有不同发病程度的感病无性系和15个无发病症状的抗病无性系，通过分析进一步筛选得到2个具有过敏性反应的强抗病的毛白杨无性系，为三倍体毛白杨 [(P. tomentosa × P. bolleana) × P. tomentosa] 无性系。利用抗病R基因NBS结构域保守区域设计简并引物，运用PCR方法从抗病无性系中克隆得到59个NBS型抗病基因同源序列（RGA）。依据进化关系，59个RGA可被划分为10个亚家族，其中具有完整开放阅读框（ORF）的54个RGA可被 进一步划分为TIR型与non-TIR型。序列比对分析发现，59个RGA在毛果杨基因组内共有96个高度同源区域，它们分布在基因组的37个位点，表明三倍体毛白杨基因组内具有丰富的NBS型抗病基因。另外，在亚家族1至3中，异义突变与同义突变的平均比值（ω）显著小于1，说明毛白杨NBS序列承受着极强的纯化选择压力，但NBS区域的一些氨基酸位点的ω值显著大于1，这些位点承受着正向选择压力。同时，在这3个亚家族的RGA中还检测到大量的基因交换，这说明基因交换在NBS序列的纯化过程中发挥着重要作用。荧光定量PCR分析发现，序列差异显著的21个RGA中有18个在三倍体毛白杨的成熟叶片、茎和根中组成型表达，但不同基因间的表达水平存在显著差异，其中2个基因的表达具有成熟树皮特异性，4个基因具有成熟叶片特异性，14个基因具有地上部分特异性，这些基因可能具有抵抗组织器官特异性病害的功能。 2、通过序列比对分析，从59个毛白杨RGA中筛选到基因DQ324288，它与美洲黑杨叶锈病抗性位点MER的基因组序列以及其中的60I2G11基因同源性高达93%；而且在28个毛白杨无性系内均发现有此同源序列，并可在叶片中呈组成型特异表达，其表达水平与毛白杨无性系的抗病能力呈正相关，表明DQ324288基因可能为毛白杨锈病抗性相关基因。在此基础上，采用RACE-PCR方法克隆到该基因家族2个成员的全长cDNA序列，分别命名为PtDRG01和PtDRG02基因。序列分析与实验结果表明，它们分别为TIR-NBS-LRR和TIR-NBS基因，在基因组内具有多拷贝，与DQ324288基因具有相同的组织表达特性，而且受伤诱导、甲基茉莉酸和水杨酸处理后表达上调，但对暗培养和农杆菌侵染无响应。生物信息学分析结果表明，PtDRG01与PtDRG02基因所编码蛋白的等电点pHi分别为8.165和10.325，且蛋白内存在大量亲水性二级结构，表明它们为碱性、亲水性蛋白。原核表达研究均可检测到目标长度的特异表达蛋白，说明所获得的PtDRG01和PtDRG02基因均具有完整的编码框，而且蛋白表达量随温度上升和诱导时间延长而增加。为了研究PtDRG01基因的功能，本研究在PtDRG01基因的正义表达载体构建的基础上，开展农杆菌介导的烟草遗传转化研究，获得了一批转基因植株。分子检测表明，