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一、材料 (二)器皿(见附录6．6) (三)DNA样品 pUCl8克隆的人的第17号染色体单体经PCR扩增的一段基因的不同克隆。 (四)试剂 1.13％PEG6000溶液：称取13克聚乙二醇6000(进口分装，分子量6000左右)，先加70毫升重蒸水，再加热充分溶解，加重蒸水定容至100毫升。1．1公斤／平方厘米灭菌20分钟。 2．4mo1/L NaCl溶液：取母液5mo1/L NaCI(见附录6．1)40毫升，加重蒸水至50毫升，于1．1公斤／平方厘米灭菌20分钟。 3. 3mol/L(pH5．6)NaAc。 4．2mol／L NaOH，2mmo1/L EDTA溶液;取母液（见附录6．1）5mol/L NaOH 2毫升，0.5mol/L EDTA 20微升，加重蒸水3毫升。 5．无水乙醇。 6．70％乙醇。 7．液氮(复旦大学自制)。 8．T7DNA测序试剂盒(Pharmacia)。 9．Eppendorf泡沫插样板。 二、方法 (一)热变性—液氮速冻法 1. 用抽提的重组双链DNA，约2~3微克／组样品，如用《小规模制备质粒DNA》方法抽提的DNA要做如下处理：将抽干的沉淀DNA各加16微升重蒸水，加4微升4mo1/LNaCl，混匀，再加20微升13％ PEG6000，混匀后存于冰水浴20分钟以上。 2．14kr／min离心10分钟，倒弃上清液，再离心2秒，用吸水纸小心移去多余的PEG。 3．用100微升70％乙醇洗沉淀一次，并且于真空干燥器抽干。 4．用12微升无菌重蒸水悬浮重组双链DNA。 5．取一洁净的Eppendorf管，按如下顺序准确加样： 退火缓冲液2微升，引物(primer)2微升，重组双链DNA10微升(2ug左右)，用手轻弹一下混匀，离心2秒钟，以集中混匀液。 6.将各组反应Eppendorf管盖紧，插入泡沫板上，整个泡沫板移入已开的水中煮3分钟。 7．迅速将沸水中的样品扔入液氮中(约10-20毫升液氮)，不要盖液氮瓶(保温瓶)盖子。 8. 10-20分钟时间里，液氮瓶内液氮不断自然挥发，Eppendorf管内样品由液氮迅速变成坚固的冰态，再变成液态（室温时），即可按《单链DNA测序》方法进行（省略退火反应步骤）。 (二)酸变性法 1．同(一)－1 2．同(一)－2。 3．同(三)－3。 4．用20微升无菌重蒸水悬浮沉淀。 5．加2微升2mo1/L NaoH，2mmo1／L EDTA溶液于20微升DNA溶液中,混匀，离心2秒钟，室温(25℃)放置5分钟。 6．各组加入3微升3mo1/L NaAc(pH5．6),加重蒸水7微升，混匀，再加75微升无水乙醇，再混匀。 7．于-70℃沉淀10分钟以上。 8．14kr／min离心10分钟，移弃上清，再用100微升70％乙醇洗一次，抽干。 9．沉淀加6微升无菌重蒸水悬浮，取1微升于0．8％琼脂糖凝胶检查浓度。 10．取悬浮的变性重组DNA 4微升，测序退火缓冲液2微升，引物(10ng／u1)4微升。 11．于37℃退火15—20分钟。 12．以下步骤按《单链DNA序列》进行(省略退火反应步骤)。 三、提示 (一)实验安排 先安排一天半时间制备重组双链DNA，DNA序列测定所要求的DNA的质量较高，费时较多。第二天下午作双链DNA变性退火处理。顺便制备序列分析的变性丙烯酰胺胶，第三天早上预电泳与作测序反应，上样电泳，下午剥胶，烘干，压片，第四天上午冲洗X-光片，读片。 (二)重组双链DNA的质量要求 DNA序列分析，对重组双链DNA质量要求较高，要求DNA超螺旋构型多，杂质去净。用实验一、二制备的双链DNA一般来讲就可以达到要求。但如果要测序重组DNA样品较多，建议可用小量制备里的几个方法，用这样的方法制备的DNA再用13％的PEG6000与NaCl沉淀一次(或用QIAEX柱纯化一次)效果也很好。PEG沉淀要求①PEG6000－8000质量要好。②PEG要去除干净。去除PEG通过第一次离心后，倒去大部分上清，第二次离心2秒种，用吸水纸搓成小纸条，伸入Eppendorf管内，与有DNA颗粒相反的面吸去残余的PEG，再用70％乙醇洗一次，抽干。 双链DNA序列分析，对分子量较大的质粒作载体的重组DNA要求更高。一般情况下，小分子量的载体，如pBR322，pUCl8，pBS等作载体的双链DNA序列都很好。但对分子量较大的载体重组DNA，过分激烈的抽提方法，易使DNA断裂，断裂的小分子DNA易在序列中用来作随机引物，造成序列结果的假条带。抽提大分子DNA，最好选用过柱方法进行。DNA的浓度要求一般在1．5—2．5微克 (二