细胞生物学73—76.docVIP

第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术 图3-25 在非洲爪蟾卵细胞提取物非细胞体系中 加入噬菌体DNA诱导 形成细胞核（N 张博,翟中和等） 一）细胞融合与细胞杂交技术 两个或多个细胞融合成一个双核或多核细胞的现象称为细胞融合（cell fusion 。 动物细胞融合一般要用灭活的病毒（如仙台病毒）或化学物质（如聚乙二醇，PEG 介 导；植物细胞融合时，要先用纤维素酶去掉纤维素壁。 20世纪80年代又发明了“电融合技术”（electronfusion method）将悬浮细胞在低压交流电场中聚集成串珠状细胞群，或对相互接触的单层培养细胞，施加高压电脉冲处 理促使融合。 细胞融合可以在基因型相同的细胞间进行，也可在基因型不同的种内细胞间甚至 种间细胞间进行。基因型相同的细胞形成的融合细胞称为同核融合细胞 homokaryon ，基因型不同的细胞形成的融合细胞称为异核融合细胞（heterokaryon 。 含有两个核的同核融合细胞可通过同步有丝分裂产生含有异常核的单核子细胞，其染 色体数为正常数目的两倍,这些染色体是从原来两个核承袭而来的。通过细胞杂交形 成的单核子细胞称为融合核细胞（synkaryon 。种间异核融合细胞也可能有增殖能力。 杂交细胞在培养过程中会发生染色体丢失现象。实验表明，在种内杂交的例子中，凡是 亲本细胞亲缘关系比较近的，则所得的杂交细胞的核型比较稳定，在连续培养中染色体 丢失的速度较慢。但在人、鼠杂交细胞中，人的染色体丢失很快。 二）单克隆抗体技术 1975年，英国科学家Milstein和Kohler将产生抗体的淋巴细胞与肿瘤细胞融合，成 功地建立了单克隆抗体（numodonal amibody 技术，他们因此而获得1984年的诺贝尔 医学和生理学奖。动物受到外界抗原刺激后可诱发免疫反应，产生相应的抗体，这一职能是由B淋巴细胞承担的，但B淋巴细胞在体外难以增殖。一些骨髄瘤细胞（TK或 HGPRT缺陷型）不分泌抗体,但在体外培养条件下可以无限传代。Milstein和Kohler为 了大最制备纯一的单克隆抗体，使小鼠骨髄瘤细胞与经绵羊红细胞免疫过的小鼠脾细 胞（B淋巴细胞）在聚乙二醇或灭活的病毒的介导下发生融合。融合后的杂交瘤细胞 具有两种亲本细胞的特性，一方面可分泌抗绵羊红细胞的抗体，另一方面像肿瘤细胞一样，可在体外培养条件下或移植到体内无限增殖。由于骨髓瘤细胞缺乏TK或HGPRT，在含氨基蝶呤的培养液内不能成活。因此，只有融合细胞才能在含HAT 次黄嘌呤、氨 基蝶呤和胸腺嘧啶核苷）的培养液内通过旁路合成核酸而得以生存。通过HAT选择培 养和细胞克隆，可以获得能大量分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。单克降抗体的制备过程如图3-26所示。 . 单克隆抗体技术设主要的优点是可以用不纯的抗原分子制备出针对某一抗原分子 上特异抗原决定簇的单克隆抗体。单克隆抗体技术与基因克隆技术相结合为分离和鉴 定新的蛋白质和基因开辟了一条广阔途径，而且在临床诊断与肿瘤等疾病的治疗中也 具有重要作用。 三）细胞拆合与显微操作技术 真核细胞是由细胞核和细胞质两大部分组成的，为了探明核质相互作用的机制，科学家们创建了细胞拆合技术。所谓细胞拆合就是把细胞核与细胞质分离幵来，然后把 不同来源的细胞质和细胞核相互结合，形成核质杂交细胞。 细胞拆合衫以分为物理法和化学法两种类细。物理法就是用机械方法或短波光把 细胞核去掉或使之失活，然后用微吸管吸取其他细胞的核，注人去核的细胞质中，组成 新的杂交细胞。这种核移植必须用显微操纵仪进行操作。化学法就是用松胞素B cytochalasin B 处理细胞，细胞出现排核现象，再结合离心技术，将细胞拆分为核体 karyuplast 和胞质体（cytoplast 两部分。由于核体外表包有一层细胞质膜和少崖胞 浆，因而在PEG或仙台病毒的介导下，核体可与另一胞质体融合，形成重组细胞。显微 操作技术（inicnrnmrHpulatioTi 是早期建立的一种胚胎学技术，即在显微镜下，用显微操 作装置对细胞进行解剖和微量注射（microinjectbn 的技术。现在显微操作装置的设计 愈来愈楮密，不仅用于核移植，而a亦可对细胞核进行解剖和向核内或动物囊胚中注人基因或细胞。 细胞拆合、显微注射与现代分子生物学技术相结合使这些经典的胚胎学技术展现 出极大的潜力，不仅成为研究核质关系、细胞内某种mRNA或蛋白质功能等的重要手 段，而且在转基因动物、髙等动物克降方面的理论与实践研究中取得了重大的突破。 如前所述，光学显微镜和电了-显微镜技术的建立与发展极大地开拓了人们的视野，发现丫细胞内各种踅杂的精细结构。然而对其成分的了解，特别是研究数以万种的基 因及其表达产物的功能，以及它们在细胞代谢与细胞生长、分