放射免疫法和ELISA之间的差别讲解.pptVIP

浙江万里学院 浙江万里学院 浙江万里学院 浙江万里学院 放射免疫法和ELISA之间的差别 放射免疫法 一、原理： 利用放射性同位素标记抗原或抗体，然后与被测的抗体或抗原结合，形成抗原抗体复合物的原理来进行分析的。 分析方法 放射免疫法分析有两种方法： 竞争性RIA,又称传统RIA 非竞争性RIA，又称免疫放射分析（IRMA * 浙江万里学院 竞争性RIA 主要特点：标记的是抗原。其原理：未知抗原Ag+标记抗原Ag＊+已知定量抗体Ab标记抗原与抗体复合物Ag＊Ab+未知抗原与抗体复合物AgAb+游离标记抗原Ag＊（去除）。 * 浙江万里学院 基本原理 Ag-Ab + Ag *Ag Ab Ag + + *Ag-Ab + *Ag B 复合物 F 游离物 *Ag与Ag的免疫活性相同 *Ag＋Ag Ab Ag * Ag , AgAb *AgAb Ag *Ag , *AgAb B *Ag F Ag *Ag , *AgAb B *Ag F * 浙江万里学院 Ag *Ag Ab *AgAb AgAb *Ag + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + * 浙江万里学院 Ag 25 50 100 200 400 800 *Ag Ab 分离B、F B% B/ B+F F% F/ B+F R B/F B1% B2% B3% B4% B5% B6% 1 2 3 4 5 6 浓度 * 浙江万里学院 B% 标 准 曲 线 * 浙江万里学院 在体外条件下, Ag与定量的*Ag对限量的特异性Ab的竞争结合反应。 B% F% B/F 1.0 2.0 Calibration Curve 60 * 浙江万里学院 （一）基本试剂 1、抗体 2、标记抗原 3、非标记抗原 （标准品） 二、基本方法 化学结构、免疫活性与被测抗原相同 高纯度 * 浙江万里学院 1、抗体 1）亲合常数K （affinity constant K） 反应抗体与抗原的结合能力 2）交叉反应率 反应抗体的specificity 3）滴度 titer 抗体的稀释倍数 B/F 0.5 1.0 复合物浓度 1 2 3 · · · · · 斜率 -K 10 100 1000 10000 100000 Ab稀释度 工作滴度 高亲和力 高特异性 高滴度 Scatchard作图 * 浙江万里学院 2、标记抗原 1）比活度和放化纯度足够高 比活度——每微克抗原上标记放射性核素的千贝可数（KBq/μg） 放化纯度——具有免疫活性的标记抗原占总放射性的百分数。 90% 2）半衰期足够长 3）保持原有抗原的特性 125I—大分子、3H or 125I—小分子 * 浙江万里学院 （二） B和F的分离 1、第一类 2、第二类 双抗体沉淀法 PEG沉淀法 固相第二抗体法 二、基本方法 + Ag Ab 1 Ab 2 试管 Ab 2 Ab 1 Ag 可溶性复合物 可沉淀复合物 * 浙江万里学院 三、质量控制（quality control） 1、精密度（precision） 变异系数（ CV ） 2、准确度（accuracy） 回收率 测定值/真实值×100% 90%~110% 3、灵敏度 （sensitivity） 方法的最小可测量 4、特异性（specificity） 交叉反应率 5、可靠性（validity） 平行性试验 6、稳定性（stability） B0%，NSB，ED25，ED50，ED75 A B C * 浙江万里学院 RIA 小 结 灵敏度高 特异性好 精确的定量 方法操作简便 * 浙江万里学院 非竞争性RIA（MISA 主要特点：标记的是抗体。按反应原理又分两种：单位点IRMA,其原理：抗原只有一个抗原决定簇，所测的抗原为小分子抗原。双位点IRMA：抗原有两个抗原决定簇，所使用的两种亚型抗体在与同一抗原分子结合时互不干扰。 * 浙江万里学院 免疫放射分析法 *Ab + Ag-*Ab + *Ab （immunoradiometric assay,IRMA） B% Ag （B） （F） * 浙江万里学院 IRMA与RIA工作原理的主要区别 RIA IRMA 竞争性抗原抗体结合反应 非竞争性抗原抗体结合反应 采用标记抗原 采用标记抗体 三种主要反应试剂 二种主要反应试剂 所用抗体是限量的 所用抗体是过量的 *AgAb的量与待测Ag的量 呈负相关 Ag*Ab的量与待测Ag的量 呈正相关 反应到达平衡慢 反应到达平衡快 非特异结合主要影响高剂量区 非特异结合主要影响低剂量区 低剂量区有不确定因素 低剂量区无不确定因素 * 浙江万里学院 ELISA