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谈食品中黄曲霉毒素B1的检测 【摘 要】食品中黄曲霉毒素的测定方法是使用GB/T18979-2003《食品中黄曲霉毒素的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法》中免疫亲和层析法高效液相色谱法进行的测定，但是在实际测定中发现许多细节问题在测定中容易忽视，而会影响测定的结果，本文针对笔者长期的实验发现的问题分别对样品的处理、标准溶液及衍生液的处理、免疫亲和柱等方面做了归纳分析。 【关键词】黄曲霉毒素B1的测定 注意事项 免疫亲和层析法高效液相色谱法 黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1简写为AFB1）是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素）。黄曲霉毒素B1是已知的化学物质中致癌性最强的一种。黄曲霉毒素B1对包括人和若干动物具有强烈的毒性，其毒性作用主要是对肝脏的损害。 B1是最危险的致癌物，经常在玉米，花生，棉花种子，一些干果中常能检测到。它们在紫外线照射下能产生荧光，根据荧光颜色不同，将其分为B族和G族两大类及其衍生物。AFT目前已发现20余种。AFT主要污染粮油食品、动植物食品等；如花生、玉米，大米、小麦、豆类、坚果类、肉类、乳及乳制品、水产品等均有黄曲霉毒素污染。其中以花生和玉米污染最严重。家庭自制发酵食品也能检出黄曲霉毒素，尤其是高温高湿地区的粮油及制品种检出率更高。黄曲霉毒素耐热，280℃才可裂解，故一般烹调加工温度下难以破坏。 本文对GB/T18979-2003《食品中黄曲霉毒素的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法》中免疫亲和层析法高效液相色谱法测定食品中黄曲霉毒素B1进行探讨： 原理 试样经甲醇-水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和柱净化，此抗体对黄曲霉毒素B1具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。用水或吐温-20/PBS将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，洗脱液通过带荧光检测器的高效液相色谱仪柱后碘液衍生测定黄曲霉毒素B1的含量。 笔者就以测定黄曲霉毒素B1出现的问题及注意事项谈几点： 1样品处理 （1）固体样品需进行样品的粉碎，通过2mm分样筛并均匀样品。 （2）样品加入甲醇水溶液提取后过滤后，应严格按标准对样品进行加水稀释处理，如果样品未稀释会造成过免疫亲和柱时黄曲霉毒素B1的含量过柱损失。 （3）样品加入甲醇水溶液提取后需高速均质1min，或在200r/min-300 r/min剧烈震荡20 min、或超声提取15 min，使样品被提取被测物充分提取。 （4）样品应用玻璃纤维滤纸过滤除去蛋白质沉淀物、粘稠性液体过滤达到样品液体净化。 （5）样品处理好后应及时检测，若不能及时检测则应将样品防止与冰箱中冷藏储存，但时间不宜过长。 （6）黄曲霉毒素B1可致癌，应戴手套进行标液的配置和样品的操作，使用过的容器应置于专用贮存容器（装有5%次氯酸钠溶液）内，浸泡24小时以上进行处理。 2标准溶液及衍生液的处理 （1）黄曲霉毒素B1标液应严格按要求进行放置保存，配置的标准工作液应放置在-18℃避光保存效果较好。 （2）柱后衍生溶液0.05%碘溶液应现用现配置，配置溶液尽可能速度快，配置后应盛放在棕色的衍生玻璃瓶中，使用前需使用0.45μm滤膜过滤并超声处理，防止不溶物堵塞管路、过滤器及限流器，使用柱后衍生系统时应先根据碘液的量在0.3-0.5Mpa下使衍生液的量通入足够的氮气。 （3）在开启试剂泵之前，确保液相色谱泵的正常工作，液体充满系统，柱压425Psi或30bar的压力后设置流速开启泵，等待压力平稳。 3免疫亲和柱 （1）过滤的样品通过免疫亲和柱吸附样品液中的黄曲霉毒素B1，从而对黄曲霉毒素B1起到针对性的纯化作用，过柱净化后的样品液可直接用于HPLC进行检测，达到快速测定的目的，以改善信噪比，提高检测方法的准确度。测定时选择合适的免疫亲和柱并了解柱子性能，严格按亲和柱说明书使用和存储，对过滤柱子的样品稀释液的PH范围进行控制，（北京华安麦科生物科技有限公司的黄曲霉毒素B1的亲和柱要求样品的PH在6-8之间，若偏离此范围需要用适量的盐酸或氢氧化钠溶液调整PH值）。样品过小柱控制在1-2滴/秒的速度流出，待液体排干后，用水淋洗柱子时可控制流速为2-3滴/秒；用1ml甲醇洗脱柱子时控制流速为1滴/1.5秒。 （2）柱子保存温度在4℃冰箱，不应冷冻，使用至少提前半小时取出放于室温下，使柱子尽量恢复到室温（22-25℃）。 （3）上柱子的样品溶液，一定要严格控制甲醇的含量不能 4 仪器设备条件 高效液相色谱仪的流动相的比例调整为甲醇-水（55+45），柱后衍生化系统衍生溶液流速调整为0.3ml/min，反应管温度70℃。黄曲霉毒素B1的峰形效果较理想。笔者测定一组黄曲霉度素B1标液标液溶度为0.001μg