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牛奶中残留抗生素的快速检测方法研究 　　摘 要：本文以新的方式将电化学生物传感器用于分析检测和鉴定牛奶中残留的抗菌药物。这种测量以生成二氧化碳的速率为基础，其中二氧化碳生成的速率与微生物生长（大肠杆菌 ATCC 11303）的抑制有关。在本试验研究中，考虑了喹诺酮和四环素类残留物。例如，与传统的筛查法，细菌抑制法和免疫测定法相比，本文研发的实验与分析方法具有如下优势：（i）分析所费时间非常短（大约120分钟）；（ii）样本量较小（大约为0.5mL）；（iii）不需要处理样本；（iv）精确度高；以及（v）可能会连续地跟踪抑制过程。此外，电化学生物传感器系统的灵敏度极高。 　　关键词：食品中残留的抗菌药物；喹诺酮；四环素；牛奶；筛查法；电化学传感器分析 　　1概述 　　抗菌药物被广泛应用于治疗养殖动物，有时也被作为生长促进剂使用[1]。这些药物的大量利用必然导致食品中留有残留物。抗菌药物残留物的存在引起了人们对消费者健康的关注。主要考虑对象为：（i）对接触过的个体可能产生的过敏性敏化作用；（ii）抗菌药物残留物甚至在浓度低于最高残留限量时也有可能对人体肠道施加选择性压力；（iii）选择抗药性细菌的可能性。 　　根据高性能的非侵入性二氧化碳传感器的具体应用情况，人们研发了电化学传感器系统，以可靠、快速、低成本的研究微生物学过程。在本研究中，作者将二氧化碳传感器用于检测和鉴定牛奶中残留的喹诺酮和四环素。这种测量以生成二氧化碳的速率为基础，其中二氧化碳生成的速率与敏感菌生长的抑制有关。本文针对喹诺酮和四环素开展了实验研究，因为人们认为应特别关注牲畜生产中最后使用的这些物质，而且这些物质能够治疗通过食物链把动物源性细菌传播至人体而导致的各种人体感染（包括胃肠道感染）。对喹诺酮和四环素的耐药性会限制许多感染的药物选择。此外，对这两种药物具有耐药性的生物体通常也会对其它类别的抗菌药物产生耐药性。这种情况下，首先必须鉴定在养殖动物中喹诺酮和四环素的使用给公共卫生造成的风险，这有助于研发适合于有效食品管理的分析方法。 　　2.实验 　　2.1 材料和试剂 　　2.1.1气体标准物质（GRMs） 　　在传感器标定中使用了浓度分别为348、1253、1745、2881和6600ppm的CO2（产自意大利罗马的SIAD Srl）。 　　2.1.2. 微生物 　　本研究所用的微生物为大肠杆菌ATCC 11303。也测试了其它微生物，但是因为大肠杆菌对喹诺酮和四环素比较敏感、繁殖时间短、更重要的是，大肠杆菌不会致病，所以选定了大肠杆菌。把细胞存储于4℃环境下的Mueller-Hinton琼脂斜面上，并在37℃环境下的Mueller-Hinton肉汤中生长。利用紫外分光光度计（确定培养基的标准为1×107 mL-1。 　　2.1.3. 标准 　　Sigma提供了四环素（TC）、土霉素（OTC）、氯四环素（CTC）、萘啶酸（NALA）、恩诺沙星（ENRO）、麻保沙星（MAR）、诺氟沙星（NOR）、环丙沙星（CIPRO）、氟甲喹（FLU）和单诺沙星（DAN）等标准品。制备了各喹诺酮和四环素在水中的标准贮备液（10mg/L），并把它们存放于-18℃的环境中。用适量的水稀释了各标准贮备液，从而制备了所有药物的标准溶液。 　　2.2. 样品制备 　　就各个被测验的抗生素而言，都用了纯牛奶样本（X0）作为对照组，分析了三种添加25（X1）、50（X2）和100（X3）μg/L喹诺酮和四环素的牛奶样品。选择了浓度为25μg/L的牛奶，因为这一浓度比牛奶的最高残留限量（即30μg/L的单诺沙星）低。牛奶中喹诺酮和四环素等其它最高残留限量都较高，在50至100μg/L范围之内。 　　制备样品时，添加了4mL培养基、0.5mL标准化的细菌培养基（1×107mL-1）作为接种物、以及0.5mL纯牛奶；而在制备对照样品时，添加了0.5mL三种不同浓度的添加药物的牛奶。 　　2.3 传感器分析 　　2.3.1 总体微生物环境因素 　　众所周知，用时间函数描绘细菌增长的实验曲线是S形曲线；曲线表示了四个不同的阶段：即迟缓期（潜生长）、对数期（指数生长）、稳定期和衰亡期。 　　命名为对数期的原因是因为通常用对数型数学模型代表这一阶段。事实上，在这一阶段，微生物（Mi）的数量增加，各繁殖时间（tr）内微生物数量翻倍增长；求得时间t时Mi（n）的数量为： 　　其中n0表示Mi的起始数量。n与2（t/tr） 之间存在指数关系；而log n与t之间存在线性关系。必须添加正确的条件，同时考虑Mi的衰亡率、基质以及微观环境因素。 　　根据方程（1），假设各微生物以恒定的速度（G，mol/s）通过呼吸生成CO2，那么求得对数期CO2的总体生成速率（C