CTAB法小量提取植物基因组DNA.docVIP

CTAB法小量提取植物基因组DNA 【实验目的】 1．理解植物基因组DNA提取的原理。 2．掌握CTAB法从植物组织中提取DNA的方法。 【实验原理】 CTAB hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵 ，是一种阳离子去污剂，在低离子强度溶液中可以沉淀核酸与酸性多聚糖，而在高离子强度的溶液中 0.7 mol/L NaCl ，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物， 而此条件下DNA呈可溶状态.。 在本实验中利用CTAB破坏细胞膜，使DNA释放出来。在高盐溶液中CTAB与蛋白质和多糖形成复合物后，再通过有机溶剂抽提去除蛋白、多糖、酚类等杂质，最后加入异丙醇即可使DNA分离出来。 【器材、试剂与材料】 1．器材 研钵、水浴锅、高速台式离心机、微量移液器、恒温箱、水平式琼脂糖凝胶电泳系统、1.5 mL Eppendorf管、Tip头。 2．试剂 1 CTAB提取液 含终浓度为100 mmol/L Tris-Cl pH 8.0 ，1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA pH 8.0 ，2% m/V CTAB溶液。 2 氯仿/异戊醇 参见实验1。 3 异丙醇 4 70% V/V 乙醇 5 RNase 10 mg/mL 母液 参见实验1。 6 限制性内切酶 7 琼脂糖 8 50×TAE 参见实验4。 9 溴化乙锭 EB 母液 【实验步骤】 1．将新鲜豌豆叶片放入经液氮预冷的研钵中，研磨，尽量细。 2．取少许材料加入1.5 mL离心管中，加入600 μL 65℃预热的CTAB 提取液，快速混匀。 3．65℃保温30 min，不时颠倒混匀。 4．待冷至室温后加入500 μL 氯仿，颠倒混匀使溶液呈乳浊状 不要振荡 ，以12,000 r/min的转速，离心5 min。 5．取上清液，加入600 μL预冷的异丙醇，颠倒混匀。 6．以2,000 r/min的转速，离心10 min，沉淀DNA，弃去上清液。依次用800 μL 70% V/V 乙醇洗涤沉淀次。 7．稍干燥，将DNA沉淀溶解于30 μL含RNase A的双蒸水，37℃保温30 min消化RNA，4℃保存。8．取10 μg 基因组DNA，用10U 特定限制性内切酶，37℃消化8-12h。 9. 在0.7% m/V 的琼脂糖凝胶上稳压电泳，检测基因组DNA及酶切情况。 【要点提示】 1．CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。 2．因为基因组DNA一般比较大，防止DNA因机械剪切而断裂，避免剧烈振荡或小孔Tip头快速抽吸溶液中的DNA。一般说来，如果操作得当，可以得到DNA分子长度达50-100kb。 3．不同的植物所含的主要杂质也不一样 如有些植物酚类物质含量较高，有的糖类含量较高 ，要根据不同植物的特性选择不同的基因组DNA提取方法。