Protocolforwesternbloting.docVIP

Protocol for western bloting Ji xiong at joint lab 07-9-7 实验准备: 分离胶 10%gel Volume 浓缩胶 Volume H2O 1.9ml 950×2ｕl H2O 700×2ｕl 30%acrylamide 1.7ml 850×2ｕl 30%acrylamide 0.33ml 1.5MTris-clPH8.8 1.3ml 650×2ｕl 1.5MTris-clPH8.8 0.25ml 10%SDS 0.05ml 50ｕl 10%SDS 0.02ml 10%APS 0.05ml 50ｕl 10%APS 0.02ml TEMED 0.02ml 2ｕl TEMED 0.002ml totel 5ml totel 2ml 电极缓冲液 1× 10× 25mM Tris-base 3.03g 30.3g 192mM Gly 18.8g 188g 1g/l SDS 1g 10g final volume 1L 1L 转膜缓冲液 volume 甘氨酸 1.45g 1.74g 2.03g Tris-base 2.9g 3.84g 4.06g SDS 0.185g 0.22g 0.259g 甲醇 100ml 120ml 140ml 水 totel 500ml 600ml 700ml TBS: PH=7.6 Tris-base 2.42g NaCl 8g H2O PH=7.4 1L TBST: 1000ml×0.05%=0.5ml Blocking buffer: TBST中含有5%BSA或5%脱脂奶粉 Incubation buffer: 1×TBST 99ml+1g BSA 在5%的凝胶中，分子量25,000—200,000的蛋白质，其分子量的对数与迁移率呈直线关系；在10%的凝胶中，10.000—70,000分子量的蛋白质呈直线关系；在15%的凝胶中，10,000—50,000分子量的蛋白质呈直线关系；3.33%（以上各种浓度的凝胶，其交联度都是2.6%）的凝胶可用于分子量更高的蛋白质。 Procedure: 1.15ｕl-20ｕl 上样,80V电泳至分离胶内,改为120V电泳至溴酚兰跑到胶外去. 2.100V转膜1h,注意排气泡和正负极.(时间依据蛋白大小确定) 3.电转后,用去离子水漂洗印记膜,然后用阻断缓冲液阻断1h(震荡速度要慢)，可4度过夜。 4.用孵化缓冲液(2-3%BSA)稀释抗体,室温振荡杂交1h(一抗要回收) 5.第一次快速,然后TBST漂洗4次,每次10min(震荡速度要慢). 6.用TBST稀释二抗,杂交1h(震荡速度要慢). 7. TBST漂洗4次,每次10min(震荡速度要快). 8.stble slution 1ml+enhancer slution 1ml 混合,将膜至于此溶液中孵育5min.用滤纸将膜吸干,并用保鲜膜封闭（避光）. 9.显影,并标记marker 位置,显影时间及每一条带的样品名称,及操作人. （抗体稀释倍数越高，条带越特异，洗得的次数越多，背景越干净，但不过度） H2O