8第八章基因工程下游技术详解.ppt

3. 细胞外分泌表达 将蛋白质分泌到细胞外是人们最期望的一种策略。因为这样容易纯化目的蛋白质，减少细菌的蛋白酶对目的蛋白质的降解。 2011-10-30 * 基因工程下游技术 4. 融合蛋白表达 在E.coli中表达外源蛋白，尤其是真核蛋白时，蛋白质的稳定性是经常遇到的问题。最近几年，众多巧妙的蛋白质——融合系统的发展，为E.coli中高效表达和纯化重组蛋白提供了极大方便。 融合表达具有多方面的优点： 防止包涵体的形成 促进蛋白质的正确折叠 限制蛋白酶解和利于纯化 2011-10-30 基因工程下游技术 * 融合表达体系 谷胱甘肽S－转移酶（GST） 麦芽糖结合蛋白（MBP） 硫氧还蛋白（Trx） 融合蛋白中目的蛋白的回收 位点特异性裂解的方法：溴化氰(Met↓)、 羟胺(Asn↓Gly)等试剂或低pH(Asp↓Pro)来进行融合蛋白的化学裂解。 酶解：反应条件较温和，所用蛋白酶具有高度的特异性，如凝血酶、肠激酶、凝乳酶和胶原酶等。所有这些酶都具有较长的底物识别序列，从而降低了蛋白质中其他无关部位发生断裂的可能性。 五、实例：粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)下游生产工艺流程 菌种划板及扩菌 2011-10-30 * 基因工程下游技术 75L发酵罐扩菌诱导,流加补料 离心收集菌体 高压匀浆破菌，洗涤提取包涵体 溶解包涵体，Sephacryl S-200分子筛柱层析 复性 超滤浓缩，Q Sepharose Fast Flow离子交换柱层析 Superdex 75 Prep Grade分子筛柱层析 分装、冻干 六、外源基因表达产物的质量检测 工业化生产的重组蛋白必须经过严格的质量控制才能成为产品。重组蛋白的质量控制指标包括： 重组蛋白的鉴别（序列） 重组蛋白的纯度（杂质的类型） 重组蛋白的活性（检测方法） 重组蛋白的安全性 重组蛋白的稳定性 重组蛋白的一致性（构象与构型） 重组蛋白产物的质量检测项目与方法 检测项目 检测方法 产品是否含内毒素 家兔热原法 蛋白质是否变异 肽谱、HPLC、等电聚焦、毛细管电泳 甲硫氨酸是否被甲酰化 肽谱、质谱、HPLC、Edman分析 蛋白质是否变性、聚合 SDS、凝胶层析、等电聚焦、质 配体是否脱落 SDS、免疫分析 氨基酸是否发生取代 氨基酸分析、肽谱、质谱、毛细管电泳 产品是否被细菌、病毒等污染 微生物学检测 谱、HPLC、毛细管电泳、Edman分析 博奥、华大、复能等 * 基因工程下游技术 第八章基因工程下游技术 2011-10-30 * 基因工程下游技术 一、概述 生物技术是利用生物的某些功能或潜能进行有效益的生产的工程技术。利用大肠杆菌、酵母等生产哺乳动物的蛋白及重要药物等都是应用生物技术的例子。 目前，世界上用生物技术生产的药物及生物制品逾数千种，年产值达数百亿美元。生物技术产品中如抗生素、人生长激素、人干扰素、乙型肝炎疫苗等在我国均已投产。 生物技术通常分成发酵工程、细胞工程、酶工程、基因工程和蛋白质工程等。生物技术以生命科学为基础，以基因工程为核心，将多种基础科学联合并使之产业化。 2011-10-30 * 基因工程下游技术 基因工程（gene engineering），也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。它利用人工方法从某一种生物中取得特定的DNA片段，称目的基因。将目的基因通过基因载体运送到受体宿主活性细胞中，并使之无性繁殖（称之为“克隆”）和行使正常功能（称之为“表达”），从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。 一般说来，基因工程是专指用生物化学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA片段）与载体系统（病毒、细菌质粒或噬菌体）的DNA结合成一个复制子。 这样形成的杂合分子可以在复制子所在的宿主生物或细胞中复制，继而通过转化或转染宿主细胞、生长和筛选转化子，无性繁殖使之成为克隆。然后直接利用转化子，或者将克隆的分子自转化子分离后再导入适当的表达体系，使重组基因在细胞内表达，产生特定的基因产物。 2011-10-30 * 基因工程下游技术 生物技术工业经过多年努力，创造了35种重要治疗药物，年销售额已超过70亿美元。全球已有生物技术制药公司2 000多家，其中美国有1300家，欧洲有700家。1997年美国的生物技术研究与开发费用为76亿美元、欧洲为18亿美元。目前主要生物技术公司多分布在美国，如Amgen、Genetics institute、Genzyme、Genentech和Chiron，还有Biogen也发展较快。经上市的生物技术药物主要含3大类，即重组治疗蛋白质、重组疫苗和诊断或治疗用的单克隆抗体。 2011-10-30 * 基因工程下游技术 我国基因