蛋白酶产生菌的分离.docVIP

蛋白酶产生菌的分离、活化选育、发酵及酶活力的测定? 许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其它微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈做初筛。也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其它蛋白酶产生菌。本实验主要包括：蛋白酶产生菌的分离纯化、产酶微生物菌种的选育、产酶微生物的发酵与酶活力的测定、蛋白酶产生菌的生长及生长曲线、培养基优化。?? 通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离蛋白酶产生菌的方法，菌种的纯化技术、高产菌的选育技术；了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线；学会培养基优化的方法；了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理；掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法。? 1?实验材料 ?1.1?实验样品? 校园内土壤样品? 1.2实验仪器与材料? 牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液番红；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、血球计数板、试管、三角烧瓶、烧杯、量筒、，玻棒、电子天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸（?pH?5．5—9．0）、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、培养皿、胶头滴管、分光光度计（应符合GB9721的规定）等。?2实验方法与步骤?2.1?培养基的配制方法? 1.称量? 按培养基配方比例依次准确地称药品放入烧杯中。? 2.溶化? 在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。? 3.调pH? 4.分装? 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。? 5．包扎? 塞好棉花的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆扎，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。? 6．灭菌? 将上述培养基以1.02kg/cm2（15磅/英寸2），121．3℃，?15-20min高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。? 7．制作平板? 将灭菌后的培养基冷凝至55~60℃,放在超净台上，点燃酒精灯，右手托起锥形瓶瓶底，左手拔下棉塞，将瓶口在酒精灯上稍加灼烧，左手打开培养皿盖，右手迅速将培养基倒入培养皿中，以铺满皿底为度。? 8．无菌检查? 待培养基凝固后，5个培养皿一叠，倒置平放在恒温培养箱中培养24—48 小时，以检查灭菌是否彻底。? 2.2蛋白酶产生菌的分离? 1）采集土壤样品，用无菌水制备1：10土壤悬液；? 2）取1：10土壤悬液5ml，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75-80?℃水浴中热处理10?min，以杀死非芽孢细菌；? 3）取加热处理过的土壤悬液100-200?μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板，将平板倒置，于30-32?℃培养24-48?h；? 4）对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。 ?2.3?蛋白酶产生菌的筛选??? 1）从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种含酪蛋白的斜面培养基，再点接于含酪蛋白的平板，30-32?℃培养24-48?h，测定平板上菌苔直径和水解圈直径。? 2）水解圈直径与菌落直径比值大的那个菌株对应的斜面培养物，可作为进 行诱变选育或酶发酵、酶活力测定菌株。? 2.4蛋白酶产生菌的选育? 2.4.1?紫外线对出发菌株的诱变效应? 1）菌悬液的制备：①?取培养48小时生长旺盛的出发菌株斜面4-5支，用10?ml?无菌生理盐水将菌苔洗下，倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。②?将上述菌液离心（3000?r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2-3次，最后制成菌悬液。③?用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。? 2）平板制作：将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板27套，凝固后待用。? 3）紫外线处理：①?将紫外线灯开关打开，预热约20分钟。②?取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述调整好细胞浓度的菌悬液3ml，并放入一根无菌搅拌棒于平皿中。③?将上述2套平皿先后置于磁力搅拌器上，打开皿盖，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟和3分钟。盖上皿盖，关闭紫外灯。? 4）稀释：在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。? 5）涂平板：取10-4、10-5、10-6 三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。? 6）培养：将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小