FLAGIPWB步骤.docVIP

IP WB protocol （以6孔板转染和FLAG-IP后WB为例，peteadam整理） 一 质粒转染及蛋白制备 1 接种293细胞入6孔板，细胞密度不宜过大，待293细胞长到大约60%时，转染质粒（具体步骤可参见lipofectmin 2000试剂说明书），加3ml没有抗生素的培养基，48h后收集细胞。 2 吸净培养基，用PBS吹洗下细胞，入1.5ml的EP管。3000rpm，4℃离心5min收集细胞 （optional:再用PBS小心漂洗一道）。 3 加入4℃预冷的300μl lysis buffer.冰上裂解细胞10min，每间隔2min涡旋一次，共5次。 4 14，000rpm，4℃，离心5min，取上清。分为两部分，一份为30μl ，加入5x protein loading buffer，混匀，75℃煮蛋白3-5min，作为input，于-20℃保存；另一份置于冰上，用于IP实验。 注意：所有的 lysis buffer都应预冷，加0.1% PMSF（现用现加）和0.5mM DTT，以保护蛋白活性。 二 准备beads 1 建议剪掉200 μl的枪尖，吸10μl FLAG 入 1.5ml的EP管中。 用800μl lysis buffer清洗一次（加lysis buffer，倒转混匀4-6次； 3000g, 4℃离心1min） 注意：应小心的去除上清，除了第一次用枪头加beads入EP管中以外，之后不论是加裂解液还是吸去裂解液，应尽量避免枪头碰到或吸到beads。 三 免疫共沉淀反应 1 用IP lysis buffer 稀释另一份蛋白裂解液到1ml，加入到处理好的beads管子中，用手轻弹混匀即可。 2 将EP管固定到混匀器上，使混匀器于4℃旋转1h-4h。 3 将免疫沉淀后的溶液于3000rpm，4℃离心1min。去上清，剩下beads在EP管中。（不要将枪头吸到beads） 4 用1ml的lysis buffer洗涤beads两次（旋转5min后，3000rpm，4℃离心1min），尽量吸净上清，只剩beads。 5 用0μl 2xprotein loading buffer将-抗原抗体复合物悬起，轻轻匀X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影1min，显影结束后，马上把X-光片浸入超纯水中洗涤1min，然后再放入定影液中，定影时间一般为1min，以胶片透明为止，最后在超纯水中洗涤1min，洗掉多余的定影液，取出晾干。 注意：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角或者用镊子夹住，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。 peteadam@yeah.net