酵母转化(陈晗俊)...docVIP

酵母转化 原理： 我们采用的是PEG/ LiAc法转化酵母。 PEG是一种高分子聚合物,只有分子量达到3000 左右的PEG才会发挥最大的转化促进作用。本文使用的PEG分子量为3350 ,实验结果表明促转化效果可以达到103～105 cfu/μg 。PEG在酵母转化中起到在高浓度醋酸锂环境中保护细胞膜,减少醋酸锂对细胞膜结构的过渡损伤,同时促进质粒与细胞膜接触更紧密。PEG的浓度是务必适宜,这一点很重要。 LiAc可使酵母细胞产生一种短暂的感受性状态,此时它们能够摄取外源性DNA 。 鲑鱼精担体DNA 为短的线形单链DNA ,在转化实验中主要是保护质粒免于被DNA 酶降解;另外还可能在酵母细胞摄取外源性环形质粒DNA 中发挥协助作用。在每次使用前务必进行热变性,使可能结合的双链DNA 打开,保证鲑鱼精担体DNA 在转化实验体系中以单链形式存在 材料、仪器设备及试剂： SD 培养基： YNB： 1.6 g/L 硫酸铵：5g/L 氨基酸：根据质粒的筛选压力选择性添加 调节pH 5.8，121°灭菌15min YPDA培养基 胰蛋白胨 20g/L 酵母浸膏 10g/L 琼脂 20g/L 固体 腺嘌呤 15ml 0.2% 腺嘌呤/ L 调节pH 7.5，121°灭菌15min 0.9%NaCl（w/v） NaCl: 0.9g milipore水 定容到100ml 灭菌121°，20min 100%DMSO 从试剂瓶中分装到ep管中，500ul每管，室温保存 10×TE（pH 7.5）： （0.1M Tris-HCl，10mM EDTA） Tris-HCl 1.211g/100ml EDTA 0.37g/100ml 调节pH 7.5, 121°，20min 10×LiAc（pH 7.5） 1M LiAc 10.202g/100ml 用醋酸调节pH 7.5，121°灭菌20min 1.1×TE/LiAc Tris-HCl 11ml 10×LiAc（pH 7.5）/100ml EDTA 11ml 10×EDTA （pH 7.5）/100ml 调节pH 7.5, 121°，20min 50% PEG3350： PEG3350： 50g 已灭菌的milipore水： 定容到100m （可用50°水浴助溶，PEG易吸水，不可灭菌） PEG/LiAc：现配现用，在超净台中操作，吸取母液到ep管或50ml离心管中 终浓度 10ml PEG3350 40% 8ml 50%PEG3350 TE buffer 1× 1ml 10×TE LiAc 1× 1ml 10×LiAc 变性的鲑鱼精DNA 10mg/ml milipore水，70%酒精棉球，50ml离心管4个，ep管一盒，15ml试管架，50ml试管架，ep管架 具体方法： A：酵母感受态制备 从平板上或保种管中，挑少许酵母，在YPDA平板上划单克隆，30°培养3天左右。 从平板上分别挑取单克隆（直径2-3mm）到含有3ml YPDA的玻璃试管中（平行做3管） 30°，250rpm，培养8-12h 取200ul 菌液，测OD600 选取OD600值最大的一个试管（即活力最高的一个），吸取5ul转移至50m新鲜的YPDA培养基中（培养基装在250ml三角瓶中） 30°，230rpm，培养16-20h，直至OD600 0.15-0.3 将培养好的菌液转入2个50ml离心管，室温离心3000g，3min，弃上清，用100ml新鲜的YPDA悬起管底的菌体，并倒入干净的三角瓶中。 30°，230rpm培养直到OD600 0.4-0.5（3-5小时） 将菌液倒入2个50ml离心管，室温离心，3000g，3min，弃上清，每个离心管用30ml milipore水重悬。 再次离心，3000g，3min，弃上清，每管用1.4ml 1.1×TE/LiAc重悬。 将重悬的菌液转移到2个ep管中，12000rpm，15s 弃上清，每管用600ul 1.1×TE/LiAc重悬，将两管重悬菌液并入一管，准备进行转化。 B：酵母质粒转化 小规模转化 大规模转化 加入质粒DNA 100-500ng 3-5ug 鲑鱼精DNA 变性的，10mg/ml 5ul 20ul 加入感受态细胞, 轻弹混匀 50ul 600ul 加入PEG/LiAc, 轻弹混匀 500ul 2.5ml 30°水浴，每10-15min轻弹混匀 30min 45min 加入DMSO, 轻弹混匀 20ul 160ul 42°水浴，每5-10min轻弹混匀 15min 20min 离心，弃上清 最大转速 3000g 15s 3min 用液体YPDA培养基重