细胞计数及细胞活率.docVIP

细胞活率细胞活率就是活细胞的比例可用台盼蓝拒染法计数活细胞:1. 彻底混合细胞悬液2. 直接用台盼蓝溶液稀释样本。例如：取20细胞悬液加入80台盼蓝溶液中。涡悬振荡，混合稀释的细胞样本。3. 血细胞计数器的准备：首先用酒精清洁其小室和盖玻片，然后用脱脂绵擦干。仔细的将盖玻片覆盖两个小室。4. 用微量移液器吸取稀释的样本充满两个小室不要过满或不足。5. 计数4个大方格中的细胞总数 1x1x0.1mm 。死细胞染成蓝色的死细胞 因为细胞完整性破坏吸收台盼蓝 ，活细胞透明有折光（未染色）。6. 计算方法：每个方格中活细胞总数平均值x稀释倍数x104 活细胞数/mL7. 活细胞百分比计算方法如下：活细胞数÷ 活细胞数+死细胞数 x100 活细胞百分比 细胞计数板使用方法 实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。 ?具体操作：? 1.?将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。? 2.?将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。? 3.?计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按公式计算：?细胞数/mL 四大格细胞总数/4×104。 说明：公式中除以4，因为计数了4个大格的细胞数。?公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：? 1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高） 0.1mm3，而?1ml 1000mm3?。 （注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液） 细胞计数板的使用?? 血球计数板-基本构造? 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有四个槽构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大格，中央的一大格作为计数用，称为计数区。计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。? 计数区边长为1mm，则计数区的面积为1mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。? 使用细胞计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液中微生物细胞的数量。? 细胞计数板-使用方法? 1．视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释100倍），以每小格的菌数可数为度。? 2．取洁净的细胞计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。? 3．将菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上（不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高），然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。? 4．静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。将细胞计数板放置于显微镜的载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。?5．计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央1个大方格的菌数（即80个小格）。为了保证计数的准确性，避免重复计数和漏记，在计数时，对沉降在格线上的细胞的统计应有统一的规定。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中。见下图：即本格中计数细胞为3个。? 6．对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2-3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），按公式计算出每mL（g）菌悬液所含细胞数量。? 7．测数完毕，取下盖玻片，用水将细胞计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。?细胞计数板-计数公式? 1、16格×25格的细胞计数板计算公式：细胞数/ml 100小格内细胞个数/100×400×10000×稀释倍数? 1、25格×16格的细胞计数板计算