塘房桔褐斑病病菌生物学特性研究剖析.doc

塘房桔褐斑病病菌生物学特性研究 摘要： 柑橘褐斑病是由链格孢属引起的一种真菌病害。在对塘房桔褐斑病致病菌生物学特性研究中，分离并纯化塘房桔褐斑病病原物，通过科赫法则验证并确定病原菌，并对其生物学特性进行研究，为今后的病害控制提供理论基础。为此，本实验控制不同条件对相同致病菌的菌丝生长情况进行深入研究。研究结果表明，相同塘房桔褐斑病致病菌在不同条件培养下，存在差异。甘露醇为碳源时，菌丝生长最好，氮源为甘露醇时有利于菌丝生长，菌丝生长情况最好的是偏中性的培养基，低温不适合菌丝生长，30℃菌丝生长情况最好，病原菌菌丝生长偏好光照。 关键词：塘房桔褐斑病 链格孢 菌丝生长 不同条件 第一章 前言 桔，是桔、柑、橙、金柑，柚、枳等的总称，柑橘原产中国。柑橘是世界第一大果树品种。在世界百果中，其种植面积和产量均居首位。 柑橘褐斑病是由链格孢属引起的一种真菌病害，链格孢属(Alternaria sp．)真菌【1】，是引起植物病害的重要真菌类群之一。目前链格孢菌侵染柑桔造成的病害【2】报道还很少。链格孢菌引起柑桔褐点病与Allbinism白化病，链格孢菌导致粗皮柠檬叶斑病、柑桔茎端腐烂病和柑桔黑腐病【3】，链格孢菌也是柑桔流胶病的致病菌之一【4】，刘娟等人在西南地区的柑桔园中发现枳橙幼苗猝死，经过分离纯化得到3株链格孢菌，其形态特征和致病存在差异【5】。链格孢菌引起的柑桔病害不仅影响柑桔的生长发育，减少产果量，而且降低柑桔果实品质，严重影响柑桔生产和果农的积极性。柑桔链格孢菌主要侵染柑桔的幼果、叶片、嫩枝及成熟果实，侵染叶片，表面产生褐斑和黄色晕圈，晕圈带有一个尾巴，这个尾巴会顺着叶脉一直延伸，形成一个眼状斑点。病原菌通过叶脉在各种管状组织中传送毒素，造成嫩梢等其他组织的损伤。侵染果实，严重时会导致幼果脱落；贮藏期间可引起果实黑腐病【6】。侵染幼苗，可造成茎端腐烂，严重时幼苗枯死。 塘房桔是近10 年来云南省马关县境内选育并大量推广种植的晚熟鲜食品种。近10年来，塘房桔已成为云南省马关县调整农业生产结构中的一个新的经济增长点，至2007年底。塘房桔的种植面积发展到584.5平方公顷，总产量达950 t，总产值达344万元。随着种植规模的迅速发展和种植时间的延长并改原来粗放管理为园艺式的集约化栽培，栽培生态的变化和管理的滞后，致使柑橘病害逐年加重。自2007～2008年始柑橘褐斑病和炭疽病【7】大规模流行。由于防治措施不利，2008年较上年减收约200万元并呈逐年恶化趋势，成为生产上亟待解决的难题。 目前对塘房桔病菌的研究很少，张玉洁，张志信，杨绪旺等人从云南马关发生的一种柑橘褐斑病的病理组织中分离得到1株病原菌,对其培养性状和形态特征进行初步研究[8]。 第二章 材料与方法 1 实验材料 1.1本实验材料采自云南省马关塘房村的塘房桔种植园基地。 1.2实验试剂 95%无水乙醇、75%无水乙醇、蒸馏水，Hcl、NaOH、葡萄糖、甘露醇、乳糖、麦芽糖、蔗糖、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、甘氨酸、硝酸钠、琼脂等。 1.3实验仪器 试管、电子天平、PH试纸、烧杯、标签纸、量筒 、胶头滴管、塑料袋、剪刀、滤纸、培养皿、酒精灯、接种针、载玻片、盖玻片、血球计数板、高压蒸汽灭菌锅、无菌操作工作台、恒温培养箱等。 2实验方法 2.1菌株的分离和纯化 参照方中达[72]的方法。分离时，从褐斑病典型病斑（见图2.1）切取一小块病组织，用70％的酒精浸泡几秒钟，转移到0.1 ％的酸性升汞水溶液中浸 2min进行表面消毒；然后用灭菌水冲洗3次，将其移置在PDA培养基上（见图2.2），室温培养。培养数天后，用接种针挑取少量菌株分生孢子（见图2.3），置于滴有灭菌水的凹玻片上，配成孢子悬浮液，稀释后，用滴管吸取一滴悬浮液置于水琼脂上，用涂布棒将悬浮液均匀涂抹水琼脂表面，超净工作台内10倍显微镜下观察，一个视野中只有一个孢子时，然后用接种针将该孢子带水琼脂移植到PDA培养基上，室温培养。 图2.1 图2.2 2.2菌种保存 在超净工作台上用灭菌接种针从平板转移少量分生孢子到事先准备好的斜面上，室温培养5-7天，等长满整个斜面后保存到4℃冰箱。 2.3 不同碳源、氮源对菌丝生长的影响 参照郑肖兰[7]的方法，选用查理固体培养基为基础培养基，分别用等量的葡萄糖、甘露醇、乳糖、麦芽糖与蔗糖置换, 配成不同碳源培养基, 高压灭菌。在PDA培养基上生长5d的菌落边缘，用直径5mm的打孔器打出菌饼，接种到不同碳源培养基上，每个平板接一个菌饼，且菌丝朝下，置27℃恒温箱中培养，每个处理3次重复，整个实验重复2次（本研究所有实验均为此重复数）。第5天用十字交叉法观察，测量菌落直径。用同样的方法以硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、甘氨