对流免疫电泳概览.pptVIP

免疫电泳技术 免疫电泳技术 是将电泳与免疫扩散相结合的一种常用的免疫学实验方法 。 沉淀反应 是可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合所出现的沉淀现象。 分类 火箭免疫电泳 是将单向免疫扩散和电泳相结合的一种定量检测技术。 定量的抗原加入到含有一定量的相应抗体的琼脂糖凝胶中，在电场的作用下，引起抗原抗体的迁移和相互反应，当抗原与抗体分子达到适当比例时，形成一个形状如火箭的不溶性免疫复合物沉淀峰，峰的高度与待捡样中的抗原浓度呈正相关。 应用 当琼脂中抗体浓度固定时，以不同稀释度标准抗原泳动后形成的沉淀峰为纵坐标，抗原浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的沉淀峰长度即可计算出待测抗原的含量；反之，当琼脂中抗原浓度固定时，便可测定待测抗体的含量 即反向火箭免疫电泳 。 对流免疫电泳 将双向免疫扩散与电泳相结合的一种技术。 此法操作简便，仅需30～60分钟，灵敏度比双向扩散高10～15倍；但缺点是特异性不如双向琼脂扩散高。 实验原理 实质上是定向加速的双向免疫扩散技术。 在pH8.6的缓冲液中，蛋白质抗原带负电荷向正极泳动；而抗体大部分属于Ig，由于分子量大，暴露的极性基团较少，在离子琼脂中泳动缓慢，同时受电渗作用的影响向负极泳动，在抗原抗体相遇的最适比例处形成乳白色沉淀线。 电渗是指在电场中液体对于一个固定固体的相对移动。琼脂是一种酸性物质，在碱性溶液中带负电荷，而与它接触的溶液带正电荷，因此液体向负极泳动，产生电渗 材料和试剂 1、AFP诊断血清： 2、肝癌病人血清：（阳性对照） 3、待检血清：人血清 4、阴性对照血清：正常人血清 5、pH8.6、离子强度0.05M巴比妥缓冲液 6、离子琼脂：用巴比妥缓冲液配制。 7、电泳仪 8、其他：打孔器、移液器，枪头 操作步骤 琼脂糖凝胶板的制备 打孔、加样 电泳 结果观察 影响结果的因素 制板、加样、打孔 用吸管吸取4ml加热溶化的琼脂铺在载玻片上,待凝。 打孔:用打孔器在琼脂板上打孔 孔距4mm ,如图。 加样:将待测抗原样品约10ul加在阴极侧孔内,抗血清加在阳极侧,加样时应加满小孔但不能溢出 电泳 将加好样品的板置于电泳槽上，抗原孔置负极端，抗体孔置正极端。琼脂板两端分别用四层纱布与0.05mol/L、PH8.6的缓冲液相连，接通电源。电流以玻片的宽度计算，为4mA/cm；电压以玻片的长度计算，为6V/cm；通电30-60min后，切断电源，观察结果 结果和讨论 将玻片对着光，先观察AFP阳性血清孔与抗体孔之间的白色沉淀线，然后再观察待检血清孔与抗体孔之间是否也有沉淀线出现，如有沉淀线，则表示AFP试验阳性，否则AFP试验为阴性。如沉淀线不清晰，可把琼脂板放在湿盒中37℃数小时或置电泳槽过夜再观察。 注意事项 1. 电泳时电流不宜过大，以免蛋白质变性。 2. 抗原、抗体的电极方向不能放反。 3. 电泳所需时间与孔间距离有关，距离越大，电泳时间越长。 4.抗原抗体浓度的比例：当抗原抗体比例不适合时，均不能出现明显可见的沉淀线。抗原太浓太稀时都不易出现沉淀线。所以除了应用高效价的血清外，每份待测样品均可做几个不同的稀释度来进行检查。 甲胎蛋白检测意义： 甲胎蛋白，简称AFP，是由胎儿肝细胞合成、在胎儿血清中正常存在的一种特殊蛋白。一般在妊娠后开始上升，至胎龄16～20周时达到最高峰，然后逐渐下降，至胎儿娩出后1-5周完全消失。 此外，原发性肝癌、急、慢性肝炎、肝硬化也可升高。原发性肝癌患者，血清中AFP阳性率常明显升高，超过400微克/升（放射免疫定量法），甚至达1000微克/升以上或呈进行性升高。AFP的检测不仅有助于原发性肝癌的诊断，而且可以作为原发性肝癌的疗效考核标准，并可判断预后。 思考题 抗原、抗体的电极反向放反了，会出现什么结果？？ 为什么对流免疫电泳试验的敏感性要比双向扩散高8-10倍？ * * 液体内沉淀试验 絮状沉淀试验 环状沉淀试验 免疫浊度测定 凝胶内沉淀试验 免疫扩散 免疫电泳 单向琼脂扩散试验 双向琼脂扩散试验 火箭免疫电泳 对流免疫电泳 沉淀反应 沉淀线形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度的关系 A：Ag、Ab浓度及扩散率近似； B：Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag＞ Ab ； C：Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag＜ Ab ； D：扩散率近似，浓度Ag ＞ Ab ； E：浓度Ag ＞ Ab，扩散率Ag ＞ Ab ； F：浓度Ag ＜ Ab，扩散率Ag ＜ Ab Ab Ag Ab：甲胎蛋白诊断血清 Ag：1、肝癌病人血清（阳性对照） 2、正常人血清（阴性对照） 3、待测血清 1 2 3