03-硕士生课-后基因组学-章跃陵-基因组测序,序列组装,基因鉴定教案.ppt

Chaper 3 结构基因组学的核心研究技术——基因组测序、序列组装与基因的鉴定 一、 DNA测序的基本方法 1、 链终止法测序(the chain termination method) 2）技术路线与要求 制备单链模板 ↓ 将单链模板与一小段引物退火 ↓ 加入DNA多聚酶 4种脱氧核苷酸 分别加入少量4种双脱氧核苷酸 ↓ 将4种反应产物分别在4条泳道电泳 ↓ 根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列 2 化学降解法测序（Maxam和Gibert于1977年发明） 2）技术路线 将双链DNA样品变为单链 ↓ 每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示DNA条带 ↓ 分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解DNA群体 ↓ 电泳,读取DNA的核苷酸顺序 3 自动化测序 1）基本原理 与链终止法测序原理相同,只是用不同的荧光色彩标记ddNTP,如ddATP标记红色荧光, ddTTP标记绿色荧光,ddCTP标记蓝色荧光, ddGTP标记黄色荧光,.由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱基. 4 、非常规测序及未来测序方法 2）单分子测序法(single-molecule seguencing) 单分子测序法是美国Los Alames国家实验室(LANL )发展的一种通过检测标记在单个分子上的荧光进行DNA快速测序的方法。模板DNA分子首先通过酶法修饰或合成，使不同的荧光素标记不同的碱基，然后，用两个激光束(或称激光镊子lasertweezer)夹住标记的DNA分子，将其置于液流系统，从被固定的核苷酸上游端开始用外切酶逐一切下被标记的核苷酸， 通过单分子荧光探测器检测液流中切下的标记核苷酸，再根据检测到的信号顺序确定DNA顺 序。 3）DNA芯片测序 4) 质谱法(mass spectrometry) 新型的电离技术如电喷雾离子化和基质辅助激光吸收技术使利用质谱法分析大片段DNA 成为可能，其中四极离子捕获效果更好。Fourier转型质谱或飞行时间质谱可进行极为敏感的进行DNA测序。 5）原子探针显微镜测序法(atomic probe microscopy) ●An overview of current and emerging technologies for genomic sequencing. ——Neil Hall . J. Exp. Biol., May 2007; 210: 1518 - 1525 Sequencing can be classified into four main strategies: in vitro cloning, in vivo cloning, amplification and mass spectrometry, and single-molecule approaches. In vivo cloning followed by Sanger sequencing is the workhorse method of most current genome sequencing projects. The mass spectrometry and single-molecule approaches are still either very specialized or in the developmental stages, although mass spectrometry methods such as the MassArray method is commonly used for single nucleotide polymorphism (SNP) analysis (Jurinke et al., 2002). The in vitro cloning technologies can be further divided into methods that employ sequencing by synthesis, such as the 454 and Solexa methods, or those that use hybridization and ligation of oligonucleotides, such as MPSS (massively parallel signature sequencing) and polony methods.