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BHK21细胞在新型微载体培养系统生长条件优化 　　摘 要：目的：使用BelloCell-500AP生物反应器和BioNOC?-II 微载体，对BHK21细胞在此新型高密度培养生物反应器中的生长特性进行研究。方法：首先将1.5×108个BHK21细胞悬液加入含有微载体的生物反应器内，按生物反应器厂家推荐参数进行培养，每天取载体计数观察BHK21的生长特性。然后调整细胞浓度和微载体培养系统运行参数。结果：BHK21细胞经过6 d培养载体中细胞总数达到峰值，细胞密度是起始接入数量的31倍为4.41×109个；经过培养过程参数优化，确定适于BHK21细胞高密度培养参数。试验成功实现了BHK21细胞的高密度培养，为以BHK21细胞为生产基质的病毒疫苗生产提供了一条简便快捷的途径。 　　关键词：生物反应器 微载体 BHK21细胞 　　中图分类号：S852．659 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2012）12（b）-00-02 　　目前我国兽医生物制品生产过程中，细胞培养设备相对比较落后，大多是在转瓶内旋转贴壁培养，不仅劳动强度大、操作复杂、容易造成污染，还经常出现细胞贴壁不均造成不同批次细胞的差异。为了提高产量，只有通过增加培养转瓶数，而这往往受到生产场地的限制，而生物反应器就弥补了这些不足。BelloCell-500AP是美国Cesco公司研发的一种能有效地使细胞内外营养和气体交换的新型固定床式生物反应器。在国内外该生物反应器已经广泛应用于HEK 293、Vero、CHO、SF-9、ST等多种哺乳动物细胞和昆虫细胞的培养[1-8]。BHK21细胞广泛用于口蹄疫、狂犬病毒、乙脑病毒等病毒疫苗的生产基质，BHK21细胞在纯悬浮培养系统和搅拌式微载体培养系统的报道比较多。本研究使用新型潮汐式固定床微载体培养系统BelloCell-500AP和BioNOC -II 片状微载体对BHK21在微载体生长特性进行研究，探索细胞增殖规律，为口蹄疫、狂犬病毒、乙脑病毒在这一新型反应器培养工艺研究作铺垫。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　BHK21细胞（中国兽医药品监察所），DMEM培养基（Gibco），胎牛血清（PAA），葡萄糖（Sigma），BelloCell-500AP高密度细胞培养系统（CESCO） 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 微载体培养BHK21细胞方法（1）细胞的接种后贴壁阶段将长满单层BHK21细胞转瓶消化后计数，取1.5×108颗细胞于30 mL培养基内备用，将470 mL含5% FBS的DMEM倒入BelloCell-500AP中，然后将准备好的BHK21细胞均匀地加入载体上，然后置于BelloStage机器，启动吸附程序。 　　（2）细胞的接种后培养阶段 吸附结束后启动培养程序，24 h后无菌条件下将载体瓶与2 L储液罐连接，启动换液程序。 　　1.2.2 细胞在微载体培养过程的培养参数的检测 　　（1）细胞核染色计数 　　从BelloCell-500AP取6片载体分装于3个含CVD（结晶紫、Triton X-100、EDTA）的1.5 mL EP管中，每管分装2片。震荡1 min后，将其置于37 ℃孵育，每隔15～20 min震荡1次，60 min后取出PBS作2～50倍稀释，取10 μL于细胞计数板加样孔进行计数，计算3个EP管中载体上的细胞总数，然后计算出每片载体片上的细胞数，根据Bellocell-500含有载体数（约865±5片）计算1个载体瓶所细胞总数。 　　（2）细胞状态和生长密度 　　从BelloCell-500AP取含有细胞的载体片放入已含95%酒精的1.5 mL离心管中浸泡5 min，将细胞脱水并固定，弃去95%酒精并以PBS洗涤一次，然后加入HE（Hematoxylin）染色剂染10 min用超纯水冲洗，将载体置于显微镜下观察细胞在微载体成长状态和密度。 　　（3）培养过程中pH值 　　无菌条件下分别从BelloCell-500AP和2 L储液罐取出少量液体，酸度计测定其pH值，根据pH值的高低分析细胞增殖对培养基酸碱度的影响，进而根据pH变化决定试验结束时间。 　　1.3 细胞在微载体培养过程中培养条件的优化 　　1.3.1 细胞接种数量对微载体培养系统下BHK21细胞生长特性的影响细胞接种浓度分别为：（1）1×108个/500 mL，（2）1.5×108个/500 mL），（3）3×108个/500 mL，其他培养参数同1.2.3中步骤，观察细胞接种密度对细胞增殖特性的影响。 　　1.3.2 微载体培养系统运行参数对BHK21细胞贴壁的影响微载体培养系统细胞贴壁阶段运行时分别于细胞接种后2 h、2.5 h、3 h、3.5